基于转录组数据筛选并验证气道上皮细胞RT-qPCR稳定参考基因

《Scientific Reports》：New validated reference genes for gene expression studies in the differentiating human airway epithelium

摘要

使用RT?qPCR分析的基因表达值通常以相对于一个或多个参考基因（RGs）的表达量来报告，假设参考基因的表达在各种实验条件下均保持稳定。然而，不同的细胞状态（如细胞分化）可能会影响参考基因的表达，从而损害RT?qPCR研究的有效性和可重复性；因此，有必要在特定细胞或组织类型中确定并验证参考基因的性能。本研究旨在为体外培养的气道上皮细胞（AE）选择合适的参考基因。利用代表不同细胞分化阶段的气道上皮培养物的RNAseq和微阵列数据，识别出最稳定表达的基因。随后，选取涵盖不同表达水平的排名前15的基因，通过RT?qPCR进行验证，并使用RefFinder工具中实现的多种算法进行评估，将其表现与常用的通用参考基因进行比较。研究鉴定出一组基因（包括TTC1、VCP、RHOA、GSS、MGAT4B和AUP1），这些基因在气道上皮培养物中的表达稳定性优于传统参考基因。在分析两个靶标基因时，将其作为参考基因可获得高度一致的结果。对所选参考基因的鉴定和严格的实验验证为气道上皮的RT?qPCR研究提供了可靠依据，这对未来呼吸疾病研究的进展具有重要意义。