表面活性辅料对气道上皮IgG跨细胞转运的影响：关于上皮屏障完整性、IgG质量及分析中基质效应的考量案例研究

《Pharmaceutics》：Airway Transepithelial Transport of IgG Formulated with Excipients: A Case Study on What to Consider Regarding Impact on Epithelial Barrier Integrity, IgG Quality and Matrix Effects During the Analytics

摘要 背景：表面活性辅料如聚山梨酯20（PS20）、聚山梨酯80（PS80）、泊洛沙姆188（Px188）和环糊精（CD）被广泛用于稳定包括气雾剂在内的免疫球蛋白G（IgG）制剂。然而，它们对IgG跨上皮转运的影响及相关分析读数的可靠性仍知之甚少。 方法：研究人员利用酶联免疫吸附试验（ELISA），在临床相关浓度的PS20、PS80、Px188或CD存在下，定量分析了贝伐珠单抗（Bevacizumab）在原代气道上皮模型中的跨上皮转运。通过细胞毒性实验（Alamar Blue、乳酸脱氢酶释放实验LDH）和屏障完整性评估（跨上皮电阻TEER）、IgG单体含量检测（体积排阻高效液相色谱SE-HPLC）、胶束形成与辅料通透性测定，以及使用含辅料的标准曲线进行ELISA基质效应评估，来判断潜在的方法学偏差。 结果：仅浓度为10 mg/mL的CD显著增加了IgG的转运，而PS20、PS80和Px188无显著影响。所有辅料均无细胞毒性，其中TEER是最敏感的指标。在所有条件下，IgG单体含量保持不变。PS20、PS80和CD的胶束形成活性得以保持，但仅有CD（10 mg/mL）能够穿过上皮屏障（达到初始浓度的11%）。辅料引起了浓度依赖性的ELISA基质效应；然而，经基质校正后的定量结果显示，对于CD而言，计算得出的IgG转运量仅有微小且不显著的改变。 结论：辅料可通过生物学机制和分析学机制影响体外IgG转运研究。在本实验条件下，由CD引起的IgG转运增加似乎是真实效应而非检测方法所致，这凸显了在黏膜IgG转运研究中控制辅料相关效应的重要性。

论文解读：表面活性辅料对气道上皮IgG跨细胞转运影响的综合评估

1. 研究背景与问题提出

治疗性免疫球蛋白G（IgG）的气雾剂递送是实现气道局部及全身治疗的有效途径，尤其适用于门诊患者，可提高依从性并降低医疗成本。然而，IgG在雾化过程中极易发生聚集，因此需要在制剂中添加表面活性辅料（如聚山梨酯20 PS20、聚山梨酯80 PS80、泊洛沙姆188 Px188和2-羟丙基-β-环糊精 CD）以维持其稳定性。尽管这些辅料的稳定化作用已有充分记载，但它们对IgG在气道黏膜处的吸收和跨细胞转运的影响却鲜有报道。此外，现有研究多采用不含上述辅料的磷酸盐缓冲液（PBS）作为介质，忽视了辅料可能带来的影响。更为关键的是，这些表面活性物质可能会干扰生物分析方法的准确性，例如通过细胞毒性破坏屏障完整性、改变IgG结构导致定量偏差，或产生基质效应影响酶联免疫吸附试验（ELISA）的读数，从而造成假阳性或假阴性的结果。因此，系统性地评估辅料在IgG转运研究中的多重潜在影响至关重要。

2. 研究内容与结论

为了阐明辅料对IgG跨上皮转运的真实影响，研究人员开展了一项系统性研究。研究首先在猪气管原代黏膜上皮细胞（TMPCs）模型中，评估了不同浓度PS20、PS80、Px188和CD对贝伐珠单抗（Bevacizumab）跨细胞转运的影响。结果表明，只有高浓度（10 mg/mL）的CD能显著增加IgG的转运量，而其他辅料在各测试浓度下均未观察到统计学上的显著变化。

随后，研究人员进行了一系列验证实验以排除可能的假象。他们发现，所有测试浓度的辅料均未表现出明显的细胞毒性，且IgG的单体含量（代表IgG质量）也未受辅料影响。进一步研究表明，PS20、PS80和CD的胶束形成活性在细胞培养条件下得以保持，但仅有CD能够穿越上皮屏障进入基底外侧室（约为初始浓度的11%）。这一发现引出了辅料在基底侧样品中可能干扰ELISA定量的担忧。因此，研究人员评估了辅料对ELISA标准曲线的基质效应，发现辅料确实会引起浓度依赖性的曲线偏移。然而，当使用含有约1 mg/mL CD（与基底侧回收浓度相当）的基质匹配校准曲线重新计算IgG转运量时，虽然定量值略有升高，但与使用非基质匹配曲线所得的结果并无统计学显著差异。

综合以上结果，研究人员得出结论：在本次研究的条件下，由10 mg/mL CD引起的IgG转运增加是一个真实的生物学效应，而非由辅料的细胞毒性、IgG聚集或分析中的基质效应所导致的假象。这项研究强调了在进行黏膜抗体递送的体外研究时，必须严格控制并验证辅料可能引入的各类干扰。

3. 主要关键技术方法

为完成本研究，研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   原代气道上皮细胞模型：从屠宰后猪的气管组织中分离原代气管黏膜上皮细胞（TMPCs），并在气-液界面（ALI）条件下培养21天，形成具备良好屏障功能的分化上皮模型。同时使用人鼻上皮细胞系RPMI 2650作为对比模型。
2. 2.
   跨上皮转运实验：将含有不同浓度辅料（PS20、PS80、CD、Px188）的IgG（贝伐珠单抗）溶液施加于TMPC模型的顶侧，24小时后收集基底侧液体，通过ELISA定量转运的IgG。
3. 3.
   细胞毒性评估组合：结合三种互补的检测方法全面评估辅料的潜在毒性，包括检测线粒体活性的Alamar Blue法、检测细胞膜损伤的乳酸脱氢酶（LDH）释放实验，以及测量屏障完整性的跨上皮电阻（TEER）。
4. 4.
   IgG稳定性分析：使用体积排阻高效液相色谱（SE-HPLC）分析在不同辅料存在下、经过24小时细胞培养条件孵育后，IgG单体含量的变化。
5. 5.
   荧光胶束实验（FMA）：利用荧光染料N-苯基-1-萘胺（NPN）嵌入辅料形成的胶束而产生荧光的原理，检测辅料在细胞培养条件下的胶束形成活性及其跨上皮屏障的通透性。
6. 6.
   ELISA基质效应评估：通过在ELISA标准品稀释液中加入不同浓度的辅料，绘制含辅料的校准曲线，并与无辅料的标准曲线进行比较，以量化辅料对IgG定量分析造成的基质效应。

4. 研究结果

3.1 不同表面活性辅料存在下的IgG跨上皮转运：真实结果还是偏差？

研究人员在TMPC模型中进行IgG转运实验，并以不含辅料的PBS组为对照。结果显示，仅10 mg/mL的CD处理组，其基底侧回收的IgG总量（3422.1 ± 1482.39 ng）较对照组（1182.35 ± 586.41 ng）有极显著增加（p ≤ 0.0001）。尽管1 mg/mL PS80组显示出IgG水平升高的趋势（1847.7 ± 913.65 ng），但未达到统计学显著性（p = 0.39）。

3.2 辅料对细胞上皮屏障模型的毒性测定

研究人员通过Alamar Blue、LDH释放和TEER三种方法，在TMPC和RPMI 2650两种模型中确定了各辅料的非毒性浓度范围。结果表明，TEER是检测屏障功能受损的最敏感指标。在TMPC模型中，PS20和PS80的非毒性上限为1 mg/mL，CD为10 mg/mL，Px188为10 mg/mL。所有后续转运实验所使用的辅料浓度均在此安全范围内，排除了因细胞毒性导致屏障泄漏而引起IgG转运增加的假象。

3.3 辅料在细胞培养条件下稳定IgG的潜力

通过SE-HPLC分析，研究人员比较了各辅料存在下IgG单体峰面积的变化。结果显示，与无辅料对照相比，所有测试浓度的辅料均未引起IgG单体含量的统计学显著变化。这表明，辅料并未通过促进或抑制IgG聚集来影响ELISA的定量结果，从而排除了因IgG质量变化导致转运假象的可能。

3.4 辅料在细胞培养条件下的胶束形成活性

FMA结果显示，PS20和PS80在37°C细胞培养条件下仍能保持其胶束形成活性，但在暴露于细胞顶侧后活性有所下降。重要的是，在基底侧样品中未检测到PS20和PS80的胶束活性，表明这两种辅料未能有效穿越上皮屏障。相反，10 mg/mL CD不仅保持了胶束活性，而且在基底侧样品中检测到了相当于初始浓度11.1%的胶束活性，估算约为1 mg/mL。这提示CD可能穿透了屏障，并可能在基底侧干扰后续分析。

3.5 辅料对ELISA的基质效应及其对转运实验结果的相关性

研究人员评估了辅料对ELISA标准曲线的影响。结果显示，PS20、PS80、低浓度CD和低浓度Px188会导致标准曲线右移，意味着会低估IgG浓度；而高浓度Px188则导致曲线左移，可能高估IgG浓度。由于只有CD能在基底侧被检测到，研究人员使用含1 mg/mL CD的基质匹配校准曲线重新计算了10 mg/mL CD组的IgG转运量。结果显示，经基质校正后，IgG转运量（349.8%）虽高于未经校正的值（289.4%），但两者之间无统计学显著差异（p = 0.4955）。这证实了CD介导的IgG转运增加主要是生物学效应，而非单纯的ELISA基质效应所致。

5. 讨论总结与研究结论

讨论总结：该研究深入探讨了表面活性辅料如何通过多种途径影响体外IgG转运研究的解读。讨论指出，辅料可能通过细胞毒性破坏屏障完整性、通过与IgG的Fc或Fab区相互作用改变FcRn介导的转胞吞作用、通过自身聚集或降解产物影响蛋白稳定性，以及通过基质效应干扰ELISA等分析方法的准确性。特别是对于环糊精（CD），其增强药物吸收的机制可能涉及增溶、内吞复合物形成或紧密连接调节，但具体机制仍需进一步研究。研究强调，尽管聚山梨酯（PS）和泊洛沙姆（Px）是常用辅料，但其稳定性（如水解、氧化）及对分析方法的影响不容忽视。荧光胶束实验（FMA）虽简便，但灵敏度有限，未来应采用更先进的色谱或质谱技术进行辅料定量。最终，讨论部分强调，辅料对分析和生物制药活性的影响因方法、药物、浓度和质量而异，需个案评估。

研究结论：表面活性辅料可通过影响细胞活力、屏障完整性、胶束形成以及基于ELISA的定量分析，显著干扰对IgG跨上皮转运结果的解读，从而可能产生假阳性或假阴性结果。在本实验条件下，使用原代呼吸道黏膜模型（TMPC）观察到的10 mg/mL CD引起的IgG转运增加，无法仅用辅料毒性、IgG聚集或分析相关的基质效应来解释，因此很可能反映了CD介导的IgG转运的真实增强效应。尽管如此，在进行体外黏膜抗体递送研究时，对辅料相关的人为因素进行严格的方法学控制是至关重要的。