《Foods》：Probiotic Potential of Limosilactobacillus reuteri JS-51 from Traditional Fermented Jiangshui: Screening, Characterization, and Hypocholesterolemic Effects
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高胆固醇血症是心血管和肝脏疾病的主要风险因素。近年来，益生菌作为一种有前景的非药物干预手段在调节脂质代谢方面受到广泛关注。本研究从中国传统发酵蔬菜饮料——浆水（Jiangshui）中筛选具有潜在降胆固醇能力的乳酸菌。首先，利用添加CaCO3的MRS琼脂培养基获
高胆固醇血症是心血管和肝脏疾病的主要风险因素。近年来，益生菌作为一种有前景的非药物干预手段在调节脂质代谢方面受到广泛关注。本研究从中国传统发酵蔬菜饮料——浆水（Jiangshui）中筛选具有潜在降胆固醇能力的乳酸菌。首先，利用添加CaCO3的MRS琼脂培养基获得52株产酸分离株。随后通过胆盐水解酶（BSH）活性筛选获得5株候选菌株。研究人员进一步评估了这些菌株的胃肠道耐受性、细胞表面疏水性和体外胆固醇清除能力。经16S rRNA测序鉴定为罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）的菌株JS-51表现出优异的益生特性：其细胞表面疏水性高达72.36±1.24%，在恶劣条件（pH 3.0和0.5%胆汁盐）下存活能力强，且在48小时内的体外胆固醇清除率最高，达55.15±1.87%。随后，在高脂饮食诱导的Sprague Dawley大鼠模型中评估了L. reuteri JS-51的体内降胆固醇功效。经过为期四周、每日口服灌胃剂量分别为106、107和108 CFU/mL的JS-51后，观察到血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇呈剂量依赖性降低（p < 0.001），同时高密度脂蛋白胆固醇升高。组织病理学分析显示，肝脂肪变性得到明显的形态学改善，肝脏指数降低幅度高达5.56%，且肝细胞结构恢复正常。这些表型发现表明，L. reuteri JS-51具备强大的体外益生潜力和有效的体内降脂能力，凸显了其作为功能性发酵剂或膳食补充剂用于管理高胆固醇血症的应用潜力。
研究背景与目的
高胆固醇血症是动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的主要风险因素。尽管他汀类药物等药物疗法能有效降低血脂水平，但其潜在的副作用和长期用药依从性问题，促使学界迫切需要寻找更安全、非药物的替代方案，例如功能性食品和膳食益生菌。传统发酵食品被认为是富含有益微生物的宝库。中国的传统发酵蔬菜，如浆水（Jiangshui），含有以乳酸菌（LAB）为主的复杂微生物群落。浆水是中国西北地区（尤其是宁夏、甘肃、山西）流行的一种传统蔬菜饮料，通过芹菜、白菜等叶菜自然乳酸发酵制成，不添加盐或商业发酵剂，最终产品呈酸性（pH 3.2–3.5）。研究人员假设，这种严苛的酸性驯化环境赋予了本地LAB优越的胃肠道存活能力。因此，本研究旨在系统性地从宁夏传统浆水中筛选和表征具有潜在降胆固醇能力的LAB，并将最有前景的分离株JS-51在高脂/高胆固醇饮食诱导的高胆固醇血症大鼠模型中进行体内评估，为其作为心血管健康管理的功能性候选益生菌菌株提供客观证据。
研究方法
研究人员采用了一系列关键技术方法进行菌株筛选与评价：
- 1.
菌株初筛与鉴定：利用添加CaCO3的MRS琼脂平板从传统宁夏浆水样品中分离产酸菌株，再通过胆盐水解酶（BSH）固体培养基上的沉淀圈进行复筛。对阳性菌株进行革兰氏染色、形态学观察和16S rRNA基因测序及系统发育分析以确定分类学地位。
- 2.
体外益生特性评价：评估候选菌株在不同pH条件下的生长能力、耐酸性（pH 2.0和3.0下的存活率）、胆汁盐耐受性（0.3%和0.5%浓度下的生长曲线）、细胞表面疏水性（采用微生物黏附碳氢化合物法测定），以及体外胆固醇清除能力（采用邻苯二甲醛法测定）。
- 3.
体内降胆固醇功效评价：使用高脂饮食（含1%胆固醇和20.2%蛋黄粉）诱导Sprague Dawley（SD）大鼠建立高胆固醇血症模型。建模成功后，将高胆固醇血症大鼠随机分为模型对照组和三个JS-51干预组（低、中、高剂量，分别对应106、107、108 CFU/mL），另设正常对照组。干预30天后，测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，计算脏器指数，并对肝脏组织进行苏木精-伊红（H&E）染色观察组织病理学变化。
研究结果
3.1 浆水中降胆固醇菌株的筛选结果
从传统发酵浆水中共获得52株具有钙溶解圈的细菌分离株。经纯化和BSH活性复筛，有5株菌（JS-29、JS-37、JS-40、JS-49、JS-51）周围形成了明显的钙沉淀圈，被选作后续研究对象。
3.2 浆水中降胆固醇菌株的鉴定结果
通过16S rRNA基因测序和系统发育分析，确定了这5株高效分离株的分类学身份。菌株JS-29被鉴定为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），JS-37为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），JS-40为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），JS-49为发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum），JS-51为罗伊氏粘液乳杆菌（L. reuteri）。所有菌株均为革兰氏阳性菌。
3.3 不同pH条件下降胆固醇菌株的生长性能
在pH≤3.0的强酸环境下，菌株JS-29、JS-37、JS-40和JS-49的增殖受到显著抑制，而菌株JS-51表现出稍好的生长能力。在极端碱性环境（pH 12.0）下，大多数菌株难以增殖，但JS-37和JS-51仍展现出良好的增殖能力。
3.4 五株降胆固醇菌株在低pH环境下的存活率
在pH 2.0和pH 3.0条件下孵育2小时和4小时后，所有5株菌的存活率均保持在70%以上，表明它们都具有抵抗强酸环境的能力。
3.5 五株浆水源降胆固醇菌株在胆汁盐环境中的生长性能
在含0.5%（w/v）胆汁盐的MRS肉汤中，菌株JS-29和JS-49的生长受到严重抑制。相比之下，菌株JS-37、JS-40和JS-51表现出更强的生长能力，其中JS-51在0至8小时内保持较高的生长速率，培养10小时后OD600值超过0.7。
3.6 菌株疏水性测定结果
细胞表面疏水性（CSH）测定结果显示，菌株JS-29、JS-37、JS-40和JS-49表现出中等疏水表型，黏附百分比不超过51%。菌株JS-51则表现出显著更强的疏水性，其疏水指数高达72.36±1.24%，显著高于其他候选菌株。
3.7 五株菌体外胆固醇清除动力学
所有菌株均表现出时间依赖性的胆固醇清除能力。菌株JS-51在所有测量时间点都表现出最高的清除能力，在48小时结束时达到峰值55.15±1.87%，显著高于其他菌株，并且在整个实验期间保持了持续上升的趋势。
3.8 大鼠初始体重分析结果
正常对照组和模型组大鼠的初始平均体重分别为196.5克和195.9克，两组间无显著差异。
3.9 高脂大鼠模型构建结果
连续饲喂高脂饲料4周后，与正常对照组相比，高脂饮食组大鼠的血清TC、TG和LDL-C水平显著升高（p < 0.0001），同时HDL-C水平显著下降（p < 0.0001），确认高脂血症大鼠模型成功建立。
3.10 菌株JS-51对高脂血症大鼠血脂的影响
经过30天干预后，与模型对照组相比，JS-51各剂量组大鼠的血清TC、TG和LDL-C水平均呈剂量依赖性降低，而HDL-C水平升高。统计分析显示，JS-51干预组与模型对照组之间存在显著差异。
3.11 菌株JS-51对高脂血症大鼠体重的影响
高脂饮食并未引起显著的体重增加，且不同剂量的JS-51补充也未对大鼠体重增长产生统计学上的显著影响。各组间的日均食物消耗量也无显著差异。
3.12 菌株JS-51对高脂血症大鼠脏器系数的影响
对于心脏、脾脏和肾脏，各实验组的脏器指数无显著差异。然而，肝脏指数显示出显著变化。模型对照组的肝脏指数（2.34±0.13%）显著高于正常对照组。JS-51干预呈现剂量依赖性降低趋势，其中高剂量组（1.0×108 CFU/mL）的肝脏指数降至2.21±0.15%，相对于未处理的模型组降低了5.56%。
3.13 菌株JS-51对高脂血症大鼠肝脏结构的影响
H&E染色显示，正常对照组大鼠肝脏结构正常。模型对照组肝脏表现出典型的严重脂肪变性特征，包括弥漫性脂滴空泡和肝细胞气球样变。JS-51干预后，特别是高剂量组，脂滴空泡的密度和大小显著减少，肝细胞结构完整性得以恢复，核回归生理中心位置，整体组织学表型接近正常对照组。
讨论与结论
研究人员认为，L. reuteri JS-51的降胆固醇功效可能涉及胆盐水解酶（BSH）活性和细胞表面物理特性的协同机制。BSH活性通过水解结合胆汁盐，促进胆汁酸沉淀和粪便排泄，从而迫使肝脏消耗内源性胆固醇进行胆汁酸的从头合成，降低血清胆固醇池。而JS-51卓越的细胞表面疏水性（72.36%）有利于其非特异性螯合和共沉淀胆固醇分子，并增强肠道黏附能力。JS-51在pH 3.0下的强劲生长能力和对高浓度胆汁盐的耐受性，是其体内发挥功能的重要前提。体内实验证实，JS-51能剂量依赖性地改善高脂饮食诱导的大鼠血脂异常和组织学肝脂肪变性，但对体重无显著影响，表明其特异性地靶向脂质代谢通路而非能量摄入。研究人员指出，本研究存在局限性，包括鉴定依赖16S rRNA测序，需全基因组测序进行菌株级分类和安全评估；极端条件下的存活率基于光密度测量，需CFU计数验证；降胆固醇机制源于体外表型推断，需多组学和粪便胆汁酸数据证实；肝脂肪变性评估主要基于定性H&E染色，需定量油红O染色验证。最终，研究结论认为，本研究成功验证了针对传统发酵食品进行生态筛选以识别稳健益生菌候选菌株的策略。从浆水中鉴定的L. reuteri JS-51因其优异的耐酸和耐胆汁盐能力、强大的BSH活性和高细胞表面疏水性，在体外表现出卓越的益生潜力。在高脂饮食诱导的高胆固醇血症大鼠模型中，口服L. reuteri JS-51能显著改善血脂异常并减轻肝脂肪变性，表现出肝保护作用。因此，L. reuteri JS-51作为开发生物活性发酵食品的功能性发酵剂具有巨大潜力。
