《International Journal of Molecular Sciences》：Autosomal Recessive RDH12-Leber Congenital Amaurosis Retinal Organoids Suggest Phospholipid Pathway Dysregulation
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NADPH依赖性视黄醇脱氢酶12（RDH12）在光感受器内节中还原全反式视黄醛（all-trans-retinal），以调节光转导级联反应并控制视网膜中类视黄醇的浓度。RDH12基因变异已被报道可导致一系列视网膜疾病表型，包括常染色体隐性（AR）Leber先天
NADPH依赖性视黄醇脱氢酶12（RDH12）在光感受器内节中还原全反式视黄醛（all-trans-retinal），以调节光转导级联反应并控制视网膜中类视黄醇的浓度。RDH12基因变异已被报道可导致一系列视网膜疾病表型，包括常染色体隐性（AR）Leber先天性黑矇（LCA）——一种严重的儿童期致盲性疾病，以及常染色体显性（AD）视网膜色素变性（RP）——一种较轻的晚发性视杆细胞优势疾病。动物模型未能重现临床表型；因此，研究人员从携带RDH12纯合错义变异c.619A>G p.(Asn207Asp)的患者（RDH12-AR）、携带杂合c.759del p.(Phe254Leufs*24)的患者（RDH12-AD）以及一名未受影响对照中，利用人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官（RO）进行了研究。RDH12-AR视网膜类器官发育出缩短的视杆和视锥光感受器（从外 limiting 膜到外节尖端），且内节中缺乏RDH12定位。批量转录组分析显示，与未受影响对照相比，RDH12-AR视网膜类器官中视锥标志物和凋亡调控异常，但与RDH12-AD相比，磷脂转运在RDH12-AR视网膜类器官中受到扰动。该研究有助于阐明RDH12视网膜病变中涉及的独特疾病通路；然而，需要更多患者来源的模型并结合同基因对照以加强研究结论，并有助于识别治疗靶点。
论文解读
一、研究背景与意义
视网膜类视黄醇代谢是视觉循环的核心环节，受到光感受器、视网膜色素上皮（RPE）和Müller胶质细胞的精密调控。光激活视紫红质和视蛋白后，光感受器外节释放全反式视黄醛，其中大部分由视黄醇脱氢酶8（RDH8）还原为全反式视黄醇，但部分泄漏至内节，由NADPH依赖性视黄醇脱氢酶12（RDH12）还原。RDH12基因变异可导致多种遗传性视网膜疾病，包括常染色体隐性Leber先天性黑矇（LCA）/早发性严重视网膜营养不良（EOSRD）、视网膜色素变性（RP）、视锥-视杆营养不良（CRD）和黄斑营养不良，以及罕见的常染色体显性RP。隐性RDH12相关LCA以进行性黄斑变性和视网膜层紊乱为特征，伴早发性暗视和明视视网膜电图（ERG）降低，患者常在三十岁前失明；显性RDH12-RP则表现为晚发性夜盲和进行性视野缺损，中心视力可保留至成年后期。既往体外细胞模型和动物模型均未能重现患者临床表型，因此亟需更接近人体生理的疾病模型。
二、研究内容与结论
研究人员利用一名携带RDH12纯合错义变异c.619A>G p.(Asn207Asp)的40岁巴基斯坦女性LCA患者的皮肤成纤维细胞，重编程为hiPSC并分化生成视网膜类器官，同时构建了RDH12-AD（杂合c.759del p.(Phe254Leufs*24)）和未受影响对照模型。研究发现RDH12-AR视网膜类器官发育出缩短的视杆和视锥光感受器，且光感受器内节缺乏RDH12蛋白定位。转录组分析揭示了视锥标志物和凋亡相关基因的失调，以及与RDH12-AD相比独特的磷脂转运通路扰动。该研究首次建立了人源性RDH12-AR视网膜类器官模型，为理解RDH12相关视网膜病变的病理机制提供了新工具，并提示磷脂通路失调可能是隐性型较显性型更严重的原因之一。
三、关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：人诱导多能干细胞（hiPSC）重编程与视网膜类器官分化体系；免疫荧光染色和TUNEL凋亡检测用于类器官表征；透射电子显微镜（TEM）用于光感受器超微结构分析；RNAscope原位杂交用于mRNA表达定位与定量；批量转录组测序（RNA-seq）结合DESeq2差异表达分析；基因本体（GO）和Reactome通路富集分析。样本来源包括一名RDH12-AR患者（纯合c.619A>G）、一名RDH12-AD患者（杂合c.759del）及一名未受影响对照，均通过hiPSC分化获得视网膜类器官。
四、研究结果
4.1 RDH12-AR视网膜类器官发育出缺乏RDH12蛋白的光感受器
在第18周，对照组和RDH12-AR类器官均发育出成熟的层状结构，含视杆和视锥光感受器，细胞活力（p = 0.42）和CRX阳性细胞核数量（p = 0.45）无显著差异，但RDH12蛋白在RDH12-AR光感受器节段中缺失。第44周时，RDH12-AR类器官细胞死亡显著减少（p = 0.02），光感受器数量与对照相当（p = 0.21）。RNA原位杂交显示RDH12 mRNA水平在两组间无显著差异（p = 0.083）。
4.2 RDH12-AR光感受器较对照缩短
第37周超微结构分析显示，两组类器官均具有发育中的外节、含线粒体的内节和完整的外 limiting 膜。光感受器密度相当（对照62 ± 5个/100 μm，RDH12-AR为41 ± 10个/100 μm），但RDH12-AR光感受器节段长度（从外 limiting 膜到外节尖端）为5.89 ± 4.44 μm，显著短于对照的10.09 ± 6.48 μm。
4.3 三种类器官对全反式视黄醛诱导的应激均表现抵抗
第41-44周类器官经100 μM全反式视黄醛处理24小时，无论培养基中是否存在视黄酸，对照组、RDH12-AR和RDH12-AD类器官均未检测到凋亡（TUNEL，p > 0.99）、氧化应激（8-OHdG、Acrolein）和内质网应激（CHOP/DDIT3、BiP/HSPA5）及自噬（LC3）的显著变化。H2O2阳性对照也未引起可检测的应激反应。
4.4 RDH12-AR视网膜类器官显示与对照和RDH12-AD不同的转录组特征
第303天转录组分析显示，RDH12-AR与对照相比有3011个差异表达基因（1520个下调，1491个上调），主成分分析PC1方差达42%。GO富集分析显示核糖核苷三磷酸酶调节活性、细胞外基质结构成分和生长因子结合等注释富集。视锥光感受器标志物下调，三个促凋亡标志物（TP53AIP1、CASP3、MOAP1）下调。36个与视网膜营养不良相关的基因差异表达（20个下调，16个上调），涉及综合征性视网膜疾病、RP、其他视网膜营养不良、全色盲、先天性静止性夜盲和视锥营养不良等。RDH12通路相关35个基因失调，涵盖视觉光转导、视杆视觉循环、维生素A代谢、视锥视觉信号转导、视黄醇生物合成和代谢等通路。RDH12-AR与RDH12-AD比较显示1828个差异表达基因（1067个上调，761个下调），两者共享离子通道和GTPase活性等通路，但RDH12-AR特异性富集ATP酶偶联膜内脂质转运活性和磷脂转运活性，涉及flippase（ATP10A、ATP8B1、ATP10B）、floppase（ABCA1、ABCB1、ABCA7）和scramblase（XKR9）等磷脂转运相关基因的失调。
五、讨论与结论
研究人员讨论指出，RDH12-AR患者ERG显示早期光感受器功能障碍，但类器官模型中细胞活力保持稳定，光感受器数量与对照相当，且促凋亡标志物下调，提示功能障碍并非由细胞死亡直接导致，而可能与光感受器节段缩短和光转导基因失调有关。RDH12蛋白缺失可能影响其与NADPH、质子受体及视黄醛的相互作用。类器官对全反式视黄醛诱导应激的抵抗可能与RDH8的代偿作用或视黄酸的保护效应有关。RDH12-AR类器官中视锥标志物下调与患者黄斑萎缩和视锥功能障碍一致。磷脂转运失调可能通过影响视觉循环蛋白和类视黄醇的回收、脂质不对称性破坏及神经炎症，加重RDH12-AR的临床表型。研究结论认为，该研究首次建立了人源性RDH12-AR视网膜类器官模型，发现光感受器缩短、RDH12蛋白缺失、视锥标志物和磷脂转运功能障碍，为理解RDH12疾病病理生理提供了新见解。未来需纳入更多患者样本并结合同基因对照，并开发RPE与视网膜类器官共培养体系以更接近体内环境，从而为治疗靶点识别提供依据。
