完整小鼠视上核血管加压素能神经元部分表达多巴胺能表型相关基因及蛋白：除多巴胺转运体（DAT）外

《International Journal of Molecular Sciences》：Partial Expression of Genes and Some Proteins Associated with the Dopaminergic Phenotype in Vasopressinergic Neurons of the Supraoptic Nucleus in Intact Mice

　　

近四十年前，首次发现视上核中的血管加压素能神经元含有酪氨酸羟化酶（TH），即多巴胺合成的第一种酶。在某些哺乳动物（大鼠）中，TH仅在应激如渗透刺激等条件下表达；在另一些哺乳动物（树鼩）中，TH在正常条件下表达；在第三类哺乳动物（人）中，TH在病理状态下表达。本研究致力于检验如下假设：血管加压素能神经元除TH外可能表达其他多巴胺能表型蛋白。为实现该目标，研究人员评估了由激光显微切割分离的完整C57BL/6小鼠视上核血管加压素免疫阳性神经元中编码多巴胺能表型蛋白的基因表达，这些蛋白包括TH、芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）、囊泡单胺转运体2（VMAT2）和多巴胺转运体（DAT）。研究人员证明，视上核血管加压素能神经元表达上述所有多巴胺能表型蛋白的基因，但多巴胺转运体（DAT）除外。在随后的免疫组化研究中，研究人员获得证据表明，除TH外，部分血管加压素能神经元含有芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC），并可能含有囊泡单胺转运体2（VMAT2）。尚需进一步研究以确定研究人员所鉴定的多巴胺能表型蛋白是否具有特定功能活性。

研究背景与问题：近四十年前，研究人员首次发现视上核（SON，下丘脑大细胞核）血管加压素能神经元含有酪氨酸羟化酶（TH，多巴胺合成第一限速酶），该酶将L-酪氨酸转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸。下丘脑肽能神经元中，除SON和室旁核大细胞神经元外，TH在完整动物中表达。在SON和室旁核，TH可在血管加压素能和催产素能神经元中表达，但多数哺乳动物仅在其慢性功能激活时表达。啮齿类SON血管加压素能神经元是研究TH表达的有前景模型，因其数量远多于催产素能神经元。TH表达作为多巴胺能表型蛋白之一，促使研究人员假设这些神经元可能还表达其他多巴胺能表型基因和蛋白。但既往结果矛盾且具种属特异性：大鼠未检测到芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC，多巴胺合成第二酶）；人PCR检测到AADC基因，但免疫组化未检测到该蛋白；完整树鼩中仅检测到AADC基因和酶。鉴于转基因小鼠广泛用于研究功能显著蛋白表达机制，研究人员近期开发了小鼠SON血管加压素能神经元渗透刺激模型。本研究目的是评估完整雄性小鼠SON血管加压素能神经元中部分多巴胺能表型基因表达和蛋白合成。

研究人员开展研究、结论与意义：研究人员使用完整雄性C57BL/6小鼠，结合激光显微切割、实时PCR和免疫组化，评估TH、AADC、囊泡单胺转运体2（VMAT2，单胺囊泡转运体）和多巴胺转运体（DAT，多巴胺再摄取转运体）。结论是SON血管加压素能神经元表达上述所有多巴胺能表型蛋白基因，但DAT除外；免疫组化证据表明，除TH外，部分血管加压素能神经元含AADC，并可能含VMAT2。其意义在于首次在小鼠中鉴定AADC免疫阳性血管加压素能神经元，表明该蛋白合成；提示这些神经元具有部分多巴胺能表型，但其功能活性仍需进一步研究。

主要关键技术方法：研究使用完整雄性C57BL/6小鼠（n = 11，8–10周龄，22–25 g），来自“Stolbovaya” breeding facility（SCBMT RAMS, Stolbovaya, Moscow, Russia）。6只用于激光显微切割及基因检测，5只用于免疫组化。主要方法包括：冷冻脑切片，Carnoy固定，血管加压素免疫荧光标记后激光显微切割分离SON血管加压素免疫阳性神经元，提取RNA，实时PCR检测 Th、Ddc、Slc6a3、Slc18a2，以 Cyc1 为内参，ΔC_t法计算。免疫组化采用双标和三标免疫荧光，检测AADC、VMAT2、TH和血管加压素，共聚焦显微镜观察，DAPI核染，黑质多巴胺能神经元作阳性对照，省略一抗作阴性对照。定量统计用配对t检验，p ≤ 0.05为显著。

研究结果：
2.1 完整小鼠视上核血管加压素能神经元中多巴胺能表型部分蛋白的基因表达
研究人员对激光显微切割制备的2400个血管加压素能神经元（来自6只小鼠，3个探针，每个3个技术重复）检测mRNA。三个制备样本中，两个检测到 Slc18a2 基因表达，第三个未检测到。唯一未检测到的mRNA是多巴胺转运体mRNA（Slc6a3）。扩增时，Th mRNA 比 Ddc mRNA 和 Slc18a2 mRNA 更早达到阈值。负 ΔC_t值表明其表达水平高于参考基因（C_t(Th) < C_t(Cyc1)）。结论：SON血管加压素能神经元表达 Th、Ddc、Slc18a2，但不表达 Slc6a3。

2.2 完整小鼠视上核血管加压素能神经元中多巴胺能表型部分蛋白的共表达
双标免疫组化显示，血管加压素和AADC在SON神经元中共定位。定量分析显示，SON额状切片平均含19.43 ± 2.13个仅血管加压素免疫染色神经元、3.9 ± 0.34个仅AADC免疫染色神经元、1.03 ± 0.15个同时免疫染色血管加压素和AADC的神经元；这意味着少于8%的SON血管加压素能神经元共表达AADC。与均匀分布的血管加压素和AADC免疫阳性物质不同，VMAT2免疫阳性物质呈点状颗粒内含物，可能属于神经元或单胺能神经纤维，因此难以识别含VMAT2的神经元，也无法定量含VMAT2免疫阳性物质的血管加压素能神经元。三标TH、AADC和血管加压素免疫染色后，共聚焦显微镜检测到罕见含三种抗原的神经元。三标TH、VMAT2和血管加压素后，检测到血管加压素和TH双标神经元，但未检测到血管加压素和VMAT2双标神经元。三标VMAT2、AADC和血管加压素后，鉴定到血管加压素和VMAT2免疫染色神经元，但VMAT2免疫阳性物质呈点状颗粒。结论：部分血管加压素能神经元含AADC，并可能含VMAT2。

讨论部分总结：近几十年技术革命使PCR、免疫酶法和免疫细胞化学等用于神经生物学研究，发现脑内除经典多巴胺能和5-羟色胺能神经元外，更多神经元部分表达多巴胺能或5-羟色胺能表型，且常共表达神经肽。血管加压素能大细胞核神经元是一类部分表达多巴胺能表型的肽能神经元。约二十年前，原位杂交和免疫细胞化学证明这些神经元含TH mRNA和TH免疫阳性蛋白。本研究旨在评估完整雄性小鼠SON血管加压素能神经元中部分基因表达和蛋白合成。不能排除性依赖调控，但需额外工作确定排卵周期；血管加压素能神经元不表达性类固醇受体，该调控由表达性类固醇受体并支配SON的其他神经元介导。本研究发现TH基因表达，但此前研究表明该蛋白缺乏酶活性，不能将L-酪氨酸转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸；TH在血管加压素能神经元中仅在免疫学特征上类似多巴胺能神经元TH。基于PCR，AADC是第二候选。此前人血管加压素能神经元通过激光显微切割PCR证明AADC基因表达，但大鼠、人、猴未检测到AADC免疫阳性血管加压素能神经元；猫SON中检测到少数AADC免疫阳性神经元，但不清楚是否在血管加压素能神经元。本研究首次在小鼠中鉴定AADC免疫阳性血管加压素能神经元，表明该蛋白合成。未来需确定AADC是否有酶活性，能否将L-3,4-二羟基苯丙氨酸转化为多巴胺。不能排除AADC也缺乏酶活性。PCR显示VMAT2基因与TH、AADC一起表达，但程度低得多。免疫细胞化学在部分血管加压素能神经元中检测到VMAT2蛋白，但呈点状颗粒，可能属于神经元或单胺能纤维。如果VMAT2确实合成，可能提供单胺从胞质摄取到分泌囊泡。假设SON血管加压素能神经元中多巴胺可由胞外L-DOPA合成，如弓状核非多巴胺能AADC神经元，但仅当AADC有酶活性。未证明AADC和VMAT2共定位。此前其他哺乳动物SON神经元中这些蛋白表达不一致：猴、猫、树鼩SON中鉴定到AADC，VMAT2仅在树鼩；人中AADC基因表达但蛋白未检测。检测中唯一未检测到mRNA的是多巴胺转运体；大鼠大细胞核神经元中也未检测到多巴胺转运体。表达多巴胺合成酶的神经元缺乏多巴胺转运体并非血管加压素能神经元独有，其他下丘脑区域尤其弓状核也有。

结论翻译：因此，本研究表明，下丘脑大细胞核的血管加压素能神经元表达一些多巴胺能表型蛋白，如AADC和VMAT2。