《Cell》：SPARCS enables scalable recovery of complex image-based phenotypes for genetic screening
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正向遗传筛选（forward genetic screening）通过引入随机遗传扰动并鉴定改变表型的突变，将基因型与表型联系起来。尽管在培养细胞中，全基因组规模筛选对于简单表型已常规化，但将其扩展至基于图像的复杂表型仍具挑战性。在此，研究人员提出空间分辨CR
正向遗传筛选（forward genetic screening）通过引入随机遗传扰动并鉴定改变表型的突变，将基因型与表型联系起来。尽管在培养细胞中，全基因组规模筛选对于简单表型已常规化，但将其扩展至基于图像的复杂表型仍具挑战性。在此，研究人员提出空间分辨CRISPR筛选（spatially resolved CRISPR screening, SPARCS），一个基于显微镜、用于单细胞图像正向遗传筛选的平台。SPARCS通过自动激光显微切割（automated laser microdissection）在原位物理分离突变体，使基于图像的筛选达到前所未有的规模，并可进行多模态命中表型分析（multimodal hit phenotyping）。研究人员在7000万个细胞中，将SPARCS用于自噬体（autophagosome）形成和免疫传感器STING激活的全基因组CRISPR敲除（knockout, KO）筛选。通过基于机器学习（machine learning）的图像分析，SPARCS恢复了大多数巨自噬（macroautophagy）基因，并鉴定GPHR为STING的pH依赖性调节因子。对分离命中细胞的基于质谱（mass spectrometry, MS）的蛋白质组学（proteomics）分析揭示了内质网（endoplasmic reticulum, ER）/高尔基体（Golgi）紊乱，并经由计算机模拟扰动建模（in silico perturbation modeling）提名了额外的STING调节因子。这些结果确立了SPARCS作为一个可扩展平台，用于具有蛋白质组水平读出（proteome-level readout）的复杂细胞表型全基因组遗传筛选。
正向遗传筛选（forward genetic screening）通过随机遗传扰动将基因型与表型关联，是解析生物系统复杂性的有力方式。CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）基因组编辑技术已可构建大规模单细胞单基因敲除（KO）文库，并对转录组、蛋白表达、空间组成、组织定位和染色质状态等复杂表型进行分析。然而，筛选文库常达到数千万至数亿细胞规模，许多现有技术难以兼容。过去基于细胞的基因组范围筛选主要局限于增殖率、细胞死亡抑制或FACS（荧光激活细胞分选）可读的荧光强度变化。显微成像可提供信息丰富的细胞表型，但受可扩展性限制：原位测序（ISS）需测序全部细胞；图像流式细胞术分辨率低且实时决策；光激活荧光标记只能分离少数表型且不能全数据集分析。为此，研究人员设定四项要求：在原位兼容先进显微技术；容纳大型文库；能从整个图像数据集中无偏识别未知表型；可对归档筛选重新分析和重选。该研究发表于《Cell》。
研究人员开发了SPARCS，一种基于激光显微切割（laser microdissection, LMD）的空间分辨CRISPR筛选平台，并在全基因组范围内筛选自噬体形成和STING转运/激活。结论表明，SPARCS可实现复杂图像表型的规模化全基因组遗传筛选，并进行多模态命中解析。
关键技术方法：细胞培养于聚苯硫醚（PPS）膜，采用旋转盘共聚焦/高内涵成像；训练卷积神经网络（CNN）单细胞图像分类器；使用Brunello全基因组CRISPR敲除文库；以py-lmd驱动Leica LMD7自动激光显微切割，切取细胞核或全细胞；扩增sgRNA并测序；对LMD分离细胞进行液相色谱-质谱（LC-MS）蛋白质组学分析；用STATE模型进行计算机模拟扰动预测。样本来源：人U2OS、HeLa细胞；CEBRA由RCH-ACV细胞系经piggyBac稳定整合C/EBPα-ESR1LBD生成。
结果1 Scalable spatial genotyping by laser microdissection：研究人员发现细胞可在PPS膜上正常生长和成像，并开发快速LMD切割流程，速度达1000个核/小时，回收率约80%。从含77,441个sgRNA的U2OS库中切取1000个核，平均鉴定549个sgRNA，与FACS相当；混合细胞实验显示至少95%测序读段定位到切取群体。结论：LMD可从成像细胞回收遗传信息，通量与遗传筛选兼容。
结果2 Validating SPARCS for genetic screening：在mCherry-LC3表达U2OS细胞中，以Torin-1诱导自噬，训练分类器1.0识别自噬体形成，FDR<1%。在120万细胞试点筛选中，ATG5 sgRNA中位富集200倍，其他自噬相关基因中位富集60倍，非靶向对照中位富集10倍；重复筛选R2=0.99。结论：SPARCS可基于图像筛选自噬体形成。
结果3 Accurate detection of autophagy defects in single-cell images：分类器1.0 AUC>0.92，但在1% FDR下召回率低于26%。改进染色、成像和训练数据后，分类器2.0的AUC>0.999，几乎100%召回；同样架构用于高尔基体形态分类，nocodazole和BFA模型AUC分别为0.988和0.999。结论：CNN可高精度分类复杂细胞器表型。
结果4 Genome-wide autophagy screen with SPARCS：研究人员对4000万个mCherry-LC3 U2OS细胞进行全基因组筛选，中位覆盖1818个细胞/基因；将自噬off命中按分类分数分为6个bin，共切取395,173个核测序。结果富集自噬核心通路基因，包括ULK1复合体和LC3脂化级联，ATG5在最富集基因中。结论：SPARCS可有效开展大规模空间表型遗传筛选。
结果5 EI24 reorganizes membranes for autophagy：非经典巨自噬基因中最富集的是EI24，富集82倍。EI24
?/?细胞在稳态下LC3脂化增加，但Torin-1诱导的LC3 puncta形成基本消失，并形成单个mCherry-LC3阳性speck。结论：EI24参与自噬体形成，具有尚未明确的功能。
结果6 Genome-wide screening for STING trafficking with SPARCS：研究人员在HeLa hsSTING1-mNeon细胞中建立四分类器，区分STING在ER、ERGIC、TGN和溶酶体定位；该分类器可强健区分SEC24C
?/?与野生型，AUPRC=0.993。筛选2940万细胞，切取2071个命中细胞，富集SEC31A、SEC24C、NSF（SEC18）、TRAPPC11和GPR89B等，ER/Golgi蛋白编码基因显著富集。结论：SPARCS可发现STING转运调节因子。
结果7 Profiling of SPARCS screening hits by mass spectrometry-based proteomics：LMD分离细胞保留完整蛋白，50个细胞可重复定量约5000个蛋白。对43个含40–60个形态相似命中细胞的pool进行蛋白质组学分析，PCA可分离命中与非命中；差异蛋白包括SEC61G、TMEM258、KDELR1等。STATE计算机模拟筛选进一步提名SEC16A、TMEM199（VMA12）、TMEM258、ARFRP1和CLCC1。结论：SPARCS支持命中细胞的多模态分子表征。
结果8 Golgi pH-dependent regulation of STING trafficking by GPR89A and GPR89B：GPR89A
?/?;GPR89B
?/?（GPR89 dKO）HeLa细胞中，diABZI刺激后STING滞留于ER，而C53刺激不受影响；回补GPR89B可恢复STING向TGN转运。GPR89 dKO细胞cis/medial Golgi和TGN pH升高；CEBRA单核细胞中GPR89 dKO导致diABZI诱导的STING、TBK1、IRF3磷酸化延迟，IFNB1和CXCL10转录受损；monensin处理可模拟该表型。结论：Golgi pH是STING转运和激活的新调控机制。
讨论部分总结：SPARCS通过改造LMD实现高通量单细胞分离，整合AI计算机视觉搜索了2.1亿张单细胞图像。全基因组筛选鉴定几乎全部已知巨自噬相关基因，发现EI24相关新自噬表型，揭示GPHR通过Golgi pH依赖方式调控STING，并实现质谱蛋白质组学与计算机模拟扰动预测的多模态解析。SPARCS可无缝整合先进显微镜，文库规模主要受成像通量限制；物理分离命中细胞支持深层表型分析，也兼容异常检测、归档重分析和开源py-lmd工具。限制包括：当前自由形态LMD显微镜切割速度为1000个核/小时；当前设置至少测序500个切取细胞的pool，无法实现单个图像到sgRNA的一一对应；计算机模拟扰动模型主要基于单细胞RNA测序训练，与蛋白质组学签名存在域偏移，可能导致假阴性。研究结论翻译：这些结果确立了SPARCS作为一个可扩展平台，用于复杂细胞表型的全基因组遗传筛选，并具有蛋白质组水平读出；SPARCS提供了一种可访问平台，能够以全基因组规模生成此类多模态扰动数据。
