《Plants》：Combined Fungal Elicitor and Methyl Jasmonate Enhance Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus Suspension Cultures: An Integrated Molecular and Phytochemical Study
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长春花（Catharanthus roseus）悬浮培养体系为研究萜类吲哚生物碱（terpenoid indole alkaloid, TIA）生物合成的调控以及具有药用价值代谢产物的生产提供了替代系统。本研究评估了内生真菌诱导子RN3（Chaetomium
长春花（Catharanthus roseus）悬浮培养体系为研究萜类吲哚生物碱（terpenoid indole alkaloid, TIA）生物合成的调控以及具有药用价值代谢产物的生产提供了替代系统。本研究评估了内生真菌诱导子RN3（Chaetomium funicola）与茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）对长春花悬浮培养细胞中生物碱积累及TIA途径相关基因表达的影响。研究人员发现，1% RN3与150 μM MeJA联合共诱导处理获得了最高的总生物碱积累量（14.68 mg g?1干重），较未处理对照提高了58.9%。高效液相色谱（HPLC）分析检测到1% RN3单独处理培养物中产生长春质碱（catharanthine），而1% RN3与150 μM MeJA联合处理后同时检测到长春质碱和长春碱（vindoline）。对共诱导培养物的植物化学研究分离得到5个化合物，包括此前未报道的木脂素类化合物catharalignan、生物碱β-咔啉（β-carboline）和四氢咔啉（tryptoline）、(+)-丁香脂素-β-D-葡萄糖苷（(+)-syringaresinol-β-D-glucoside）以及L-胸苷（L-thymidine）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析显示，转录因子基因ORCA2和ORCA3在诱导处理后3天期间始终维持显著高表达水平，而所检测的TIA途径结构基因仅表现出有限的转录变化。上述发现表明，RN3尤其是与MeJA联合使用时，能够增强生物碱积累并调控TIA途径相关基因的转录响应。
论文解读：真菌诱导子与茉莉酸甲酯联合调控长春花悬浮培养细胞生物碱积累的分子与植物化学整合研究
一、研究背景与科学问题
长春花（Catharanthus roseus）是研究最为深入的药用植物之一，因其能够合成多种萜类吲哚生物碱（terpenoid indole alkaloid, TIA）而备受关注。其中，长春质碱（catharanthine）、长春碱（vindoline）、阿吗碱（ajmalicine）、蛇根碱（serpentine）、长春花碱（vinblastine）和长春新碱（vincristine）等因具有重要药理活性而受到广泛重视。然而，这些珍贵生物碱在植物体内含量极低，商业化生产面临巨大挑战。因此，体外细胞悬浮培养体系被开发为在受控条件下研究生物碱代谢和提升产量的替代系统。
在提升植物细胞培养物中次生代谢产物产量的策略中，诱导子处理是最有效的方法之一。非生物诱导子如茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）和生物诱导子如真菌来源诱导子均可激活植物防御信号并刺激次生代谢产物生物合成。在长春花中，MeJA是调控TIA生物合成相关基因的关键信号分子，已被广泛用于提升细胞悬浮培养和毛状根中TIA的积累。真菌来源诱导子同样受到关注，因其能激活植物防御反应并刺激生物碱合成。已有研究表明，从长春花中分离的内生真菌，尤其是尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），可刺激生物碱产生。研究团队前期工作证实，内生真菌Fusarium solani RN1和Chaetomium funicola RN3的细胞提取物可显著提高长春花悬浮培养细胞的生物碱积累。
TIA生物合成是植物中最复杂的次生代谢途径之一，涉及分布于多个亚细胞区室的30余个酶促步骤。色氨酸来源的色胺与裂环马钱素苷（secologanin）在异胡豆苷合酶催化下缩合形成异胡豆苷（strictosidine），后者是130多种单萜吲哚生物碱的中心前体。代表性结构基因包括色氨酸脱羧酶（TDC）、牻牛儿醇10-羟化酶（G10H）、异胡豆苷合酶（STR）、异胡豆苷β-葡萄糖苷酶（SGD）、脱乙酰氧基长春碱4-羟化酶（D4H）和脱乙酰长春碱O-乙酰转移酶（DAT）等，这些基因常被用于监测对诱导处理的转录响应。这些基因的表达受多个茉莉酸响应的AP2/ERF转录因子调控，尤其是ORCA2和ORCA3，它们是TIA生物合成的重要调控因子。
尽管已有研究分别证明了真菌诱导子和MeJA在提升长春花生物碱产量方面的潜力，但诱导子引发的响应高度依赖具体条件，长春花悬浮培养细胞对真菌诱导子和MeJA在细胞生长、生物碱积累、TIA相关基因表达及代谢物谱方面的协同响应仍缺乏充分理解。因此，本研究旨在系统考察内生真菌诱导子RN3与MeJA单独或联合处理对长春花悬浮培养细胞生长、生物碱积累、TIA相关基因表达及代谢物谱的影响，并进一步对生物碱积累最高的处理进行植物化学研究以分离和鉴定代谢产物。
二、主要技术方法
研究采用长春花H01悬浮细胞系，该细胞系于2023年由越南顺化市郎姑采集的长春花品种roseus茎来源愈伤组织建立。诱导子在培养第18天（对数生长后期）施加。RN3真菌诱导子由Chaetomium funicola Cooke菌株经培养、干燥、研磨、高压灭菌后制备细胞提取物。处理组包括1%或2%（v/v）RN3、100或150 μM MeJA、以及1% RN3与150 μM MeJA联合处理。生物碱含量采用重量法测定，结合薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）进行定性分析。基因表达分析采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR），以RPS9为内参基因，检测了ORCA2、ORCA3及TDC、STR、G10H、SGD、T16H、T3O、T3R、D4H、DAT、PRX1等结构基因的表达。大规模培养采用50个2-L摇瓶共50 L培养体系，经溶剂萃取和多种色谱技术（包括硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、反相硅胶及制备型HPLC）分离纯化化合物，并通过高分辨质谱（HR-ESI-MS）、核磁共振（NMR）和圆二色谱（CD）鉴定化合物结构。
三、研究结果
3.1 生物量生长
H01细胞系表现出稳健稳定的生长特性。诱导处理后连续6天监测鲜重和干重，鲜重在处理后第3天（四种培养物）或第4天（两种培养物）达到最大值，干重则在所有培养物中均于第3天达到最大值后逐渐下降。因此选择处理后72小时（第3天）进行生物碱和植物化学分析，基因表达则在诱导后24、48和72小时进行评估。
3.2 真菌诱导子与茉莉酸甲酯对生物碱积累的影响
诱导处理后72小时评估各处理的重量法生物碱含量。与未处理对照（9.24 mg g?1 DW）相比，1% RN3处理显著提高生物碱含量至11.71 mg g?1 DW，而150 μM MeJA单独处理仅引起轻微增加。2% RN3处理反而降低了生物碱积累。最高生物碱含量（14.68 mg g?1 DW）出现在1% RN3与150 μM MeJA联合处理组，较对照提高58.9%。TLC分析显示联合处理组生物碱条带强度最强，证实联合处理在所有测试处理中产生最强的生物碱响应。
3.3 代表性TIA的HPLC分析
HPLC定性分析显示，仅在1% RN3单独处理或1% RN3与150 μM MeJA联合处理的培养物中检测到与标准品保留时间一致的峰。1% RN3处理的色谱图在31.050 min处显示主要峰，对应长春质碱；联合处理组在23.049 min和31.050 min处显示两个主要峰，分别对应长春碱和长春质碱。未处理对照、MeJA单独处理及2% RN3处理的培养物中均未检测到相应峰。所有样品中均未检测到长春花碱或长春新碱。
3.4 TIA途径代表性基因的选择性转录响应
基因表达分析选取1% RN3、150 μM MeJA及其联合处理三种处理。结果显示，ORCA2和ORCA3在诱导处理组中的转录水平显著高于未处理对照。联合处理在24小时时诱导效果最强，ORCA2和ORCA3转录水平分别较对照提高29.8倍和18.8倍。尽管在48和72小时有所下降，但仍显著高于对照和其他处理。相比之下，所有检测的结构基因在所检测的时间点均未出现显著转录变化。
3.5 H2L组分的化合物分离与鉴定
大规模提取获得6.8 g生物碱富集组分H2L，经反复色谱分离得到5个化合物。已知化合物鉴定为(+)-丁香脂素-β-D-葡萄糖苷（2）、四氢咔啉（3）、β-咔啉（4）和L-胸苷（5）。化合物1为淡黄色蜡状物，经HR-ESI-MS确定分子式为C28H38O12，通过综合波谱分析（包括1D和2D NMR及CD实验）确定其结构和绝对构型，鉴定为一种此前未报道的木脂素糖苷，命名为catharalignan，绝对构型确定为7S, 7′S, 8R, 8′R。
四、讨论与结论
讨论部分指出，RN3与MeJA联合处理在适度降低生物量的同时显著提高总生物碱积累，表明联合处理比单独处理更有效，这可能反映了RN3和MeJA激活不同但重叠的防御信号通路并刺激次生代谢的互补效应。HPLC检测到联合处理后同时出现长春质碱和长春碱，但未检测到下游双吲哚生物碱长春花碱和长春新碱，可能表明在所用条件下向双吲哚生物碱的转化受限。尽管ORCA2和ORCA3被强烈诱导，但结构基因未显示协调上调，这与此前研究中ORCA3过表达仅能激活部分结构基因的发现一致，也提示转录因子诱导本身不足以驱动下游TIA生物合成基因的协调激活。此外，诱导子处理后24小时之前的早期转录事件、ORCA蛋白的翻译后调控以及负调控因子的参与均可能影响最终代谢结果。β-咔啉和四氢咔啉的分离表明色胺衍生代谢可能通过经典TIA途径之外的途径进行。新木脂素catharalignan的发现扩展了长春花悬浮培养体系中已鉴定的次生代谢产物范围。
研究结论指出，RN3与茉莉酸甲酯联合诱导可提高长春花H01悬浮培养细胞的总生物碱积累。该处理显著提高ORCA2和ORCA3转录水平，而所检测的结构基因未显示显著转录诱导。联合诱导后检测到长春质碱和长春碱，同时从共诱导培养物中分离得到两种色胺衍生生物碱和此前未报道的木脂素catharalignan。这些发现表明，共诱导的H01悬浮培养体系同时含有代表性TIA和色胺衍生生物碱，以及新木脂素catharalignan，凸显了该培养体系在研究诱导子相关生物碱响应和植物化学发现方面的价值。
