全基因组CRISPR筛选发现血红蛋白结合素是肉毒神经毒素A型和C型的非神经元受体

《Cell Reports》：Genome-wide CRISPR screening identified hemojuvelin as a non-neuronal receptor for the botulinum neurotoxin serotypes A and C

亮点

• HJV是一种结合受体，驱动BoNT/A和BoNT/C在细胞膜上的富集
• HJV通过其C端结构域与BoNT/A和BoNT/C的HCR结构域结合
• HJV缺陷显著降低了毒素诱导的小鼠趾瘫痪和致死性

摘要

肉毒神经毒素（BoNTs）主要通过神经受体和神经节苷脂进入细胞。然而，使它们特异性富集在神经肌肉接头（NMJ）的机制仍知之甚少。在本研究中，通过全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定出血红素铁调素（HJV）——一种在骨骼肌中大量表达的膜蛋白——作为BoNT/A和BoNT/C的非神经元受体。基因敲除和回补实验表明，HJV介导毒素结合，其机制是通过其C端区域（155–393位氨基酸残基）与毒素受体结合域（HCR）内的WY环直接相互作用。在小鼠中，HJV敲除显著降低了毒素在肌膜上的富集，并显著减弱了毒素敏感性，如趾瘫痪和致死性。因此，HJV在肌膜上捕获这些毒素，为神经元受体在NMJ处高效识别和内化建立了关键前提。这些发现进一步完善了BoNTs在体内的进入机制，并为治疗BoNT中毒及优化其临床应用提供了可操作的见解。

图形摘要

引言

肉毒神经毒素（BoNTs）是破伤风梭菌分泌的最具毒性的神经毒素，它们靶向运动神经末梢以阻断乙酰胆碱的释放，导致弛缓性麻痹，可能因呼吸麻痹而导致死亡。该毒素由50 kDa的轻链（LC）和100 kDa的重链（HC）组成，通过二硫键相连。HC可进一步识别为50 kDa的N端HCN结构域和50 kDa的C端HCR结构域。在中毒过程中，HCR结构域特异性结合宿主细胞表面，通过内吞作用使BoNTs进入细胞。随后，HCN结构域在低pH环境中发生构象变化，在内体膜上形成通道以将LC递送到细胞质中，在那里LC催化SNARE蛋白的裂解。BoNTs可根据血清学差异分为A–G型和X型亚型。BoNT/A和BoNT/E裂解突触素相关蛋白25 kDa（SNAP-25），而BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G和BoNT/X裂解囊泡相关膜蛋白2（VAMP-2），最具独特性的毒素亚型BoNT/C同时裂解SNAP-25和突触 SNAP-25。

对于BoNTs的细胞内化过程，双重受体模型已被广泛接受。神经节苷脂和细胞表面的特定蛋白协同形成高亲和力毒素受体复合物并特异性富集BoNTs。靶细胞膜上缺乏神经节苷脂可降低BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/E和BoNT/G的结合和进入。不同的神经节苷脂在不同血清型BoNTs的识别和结合中发挥关键作用。一旦被神经节苷脂捕获，随后的附着促进BoNT与相应蛋白受体的结合。SV2是BoNT/A、BoNT/D、BoNT/E和BoNT/F的蛋白受体，而突触素I/II（Syt I/II）是BoNT/B和BoNT/G的蛋白受体。BoNTs与其蛋白受体之间的相互作用对其细胞进入和毒素活性贡献巨大。然而，对于BoNT/C，仅有两种神经节苷脂——GD1b和GT1b——被识别为其受体，而其蛋白受体仍未知。已有报道表明BoNT/C可通过网格蛋白介导的内吞作用被内化，这表明可能也存在参与BoNT/C内化过程的蛋白受体。

在BoNT血清型中，BoNT/A已被广泛应用于临床和医疗美容领域。尽管其疗效可持续3–6个月，但反复注射可诱导中和抗体，且有一定比例的患者对BoNT/A无应答。作为治疗替代方案，BoNT/B也已获批临床使用，但其作用时间短限制了更广泛的应用。据报道，BoNT/C在几项临床试验中表现出与BoNT/A相似的作用持续时间和疗效，这可能是一种克服BoNT/A临床应用相关问题的有前途的替代方案。不幸的是，BoNT/C的受体仍未被鉴定，限制了其潜在的临床前景。尽管BoNT内化的神经元双重受体模型已确立，但局部给药后BoNTs高效递送至神经肌肉接头（NMJ）的分子机制在很大程度上仍未被阐明。先前的研究几乎完全集中在神经元受体上，但非神经元组织中的潜在受体，尤其是在骨骼肌中的受体，仍未被探索。可能存在一种蛋白质的非神经元受体，介导BoNTs在骨骼肌表面的结合和富集，作为此前未被认识的关键步骤，对其强大的体内毒性至关重要。

在本研究中，我们利用全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定了介导BoNT/C细胞进入的宿主因子。其中，血红素铁调素（HJV）被发现作为BoNT/C和BoNT/A的潜在非神经元受体。随后，进一步研究HJV以验证其能否直接与毒素HCR相互作用，通过荧光显微镜和pull-down实验确定了相互作用片段和残基。在细胞中敲除HJV后，评估了BoNT/A和BoNT/C的细胞摄取和酶促裂解活性，并在小鼠中敲除HJV后测试了毒素的生物活性和疗效。我们的结果为深入理解BoNT中毒机制提供了有价值的线索，并为BoNT/C的临床前景和转化发展提供了重要证据和理论支持。

结果

全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定了介导BoNT/C细胞结合的候选基因

神经节苷脂已被证明是BoNT/C的关键受体。因此，它们可能直接或间接掩盖BoNT/C HCR（BCHCR）与蛋白受体的结合。为排除这种可能性，本研究选择了Neuro-2a细胞系作为理想的工具细胞系，因为先前的工作表明该细胞系缺乏GT1b神经节苷脂的表达。为鉴定对BoNT/C细胞结合至关重要的宿主细胞因子，我们进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，使用EGFP标记的BoNT/C HCR（EGFP-BCHCR）结合Neuro-2a细胞，可通过流式细胞术高效分选（图1A）。经过三轮富集筛选后，文库A中EGFP阴性细胞的比例从1.74%增加到49.6%，而文库B中从1.74%增加到29.5%（图1B）。通过下一代测序（NGS）解析了EGFP-BCHCR结合阴性细胞群中的单导向RNA（sgRNA）序列。基于每个基因的sgRNA读数、独特sgRNA数量和R3/R0富集倍数，从前30个命中结果中鉴定出四个膜定位基因作为候选受体，每个基因至少被两个独特的sgRNA靶向：转铁蛋白受体2（Tfr2）、Hjv、纤溶酶原受体C端赖氨酸跨膜蛋白（Plgrkt）和低密度脂蛋白受体相关蛋白3（Lrp3）（图1C、1D和1E）。

图1 CRISPR-Cas9全基因组筛选鉴定肉毒神经毒素C型受体

（A）用于鉴定BoNT/C受体的全基因组筛选过程示意图。（B）阴性对照细胞的荧光强度与经多轮荧光激活细胞分选后文库A和文库B中分选细胞的对比。（C）富集基因的单个gRNA类型数量及其读数的统计。（D）基于具有两个以上独立gRNA的原则对前30个基因进行排名。（E）CRISPR筛选后候选基因sgRNA的富集趋势。

鉴定的四个候选受体已知具有不同的生理功能：Tfr2是转铁蛋白受体样家族的成员，介导铁蛋白结合铁的内分泌摄取并调节肝脏铁调素表达以维持全身铁稳态。TFR2突变与Ⅲ型遗传性血色素沉着症相关。Hjv是铁代谢的核心调节因子，在肝脏、心脏和骨骼肌中高度表达。它通过骨形态发生蛋白（BMP）/Smad信号通路调节铁调素。HJV突变导致Ⅱ型遗传性血色素沉着症。Plgrkt编码一种跨膜纤溶酶原受体，调节细胞表面纤溶酶原激活和纤溶。它参与炎症反应、巨噬细胞迁移、组织修复和神经内分泌激素加工。Lrp3属于LDL受体家族的成员，结合多种配体，包括脂蛋白和细胞外基质成分。LRP3参与脂质代谢以及Wnt信号通路介导的细胞迁移和粘附。虽然其功能障碍与心血管疾病和癌症有关，但其具体的生理作用仍有待完全阐明。

在本研究中，BoNT/C使用大肠杆菌表达系统重组生产（图S1A），通过腹腔注射确定的小鼠半数致死量（LD50）为62.5 pg。为选择对BoNT/C敏感的细胞系用于CRISPR-Cas9筛选，我们检测了SNAP-25和突触素-1底物蛋白的表达水平。此外，在永生化小鼠海马HT-22细胞和小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞中进行了BoNT/C酶促裂解实验。结果显示，在HT-22细胞中仅能检测到SNAP-25，而不能检测到突触素-1，且BoNT/C处理后未检测到被裂解的SNAP-25（图S1E）。相比之下，Neuro-2a细胞中高表达SNAP-25和突触素-1，且两者均被BoNT/C以浓度依赖性方式显著裂解（图S1F）。由于HCR结构域是所有其他BoNT血清型的受体结合域，BCHCR和EGFP-BCHCR也通过大肠杆菌表达系统重组生产（图S1B）。其中，EGFP-BCHCR能够高效且特异性地结合大鼠原代海马神经元，而EGFP对照则不能（图S1C），且该结合可被BCHCR竞争性消除（图S1D）。因此，EGFP-BCHCR被用作全长BoNT/C的替代配体以避免细胞毒性。

HJV是BoNT/C细胞表面结合和内化的必需因子

为研究这些受体是否介导BoNT/C的细胞摄取，我们利用CRISPR-Cas9构建了四个候选基因的单个敲除Neuro-2a细胞系（图S2A–S2D）。流式细胞术分析显示，只有HJV敲除显著降低了EGFP-BCHCR结合信号，降至与阴性对照相当的水平（图2A和S2G）。一致地，只有HJV敲除抑制了BoNT/C的内化并赋予细胞抗性，而其他三个候选基因的敲除则无影响（图2B和2C）。为排除脱靶效应，我们还使用单质粒CRISPR-Cas9系统产生的纯合HJV敲除克隆（2# Hjv?/?）验证了这些发现（图S2E和S2G）。结果显示，在所有毒素剂量下，杂合4# Hjv+/?和纯合2# Hjv?/?细胞中的SNAP-25和突触素-1几乎保持完整，而野生型（WT）细胞中则发生大量裂解（图2G和2H）。荧光成像进一步表明，EGFP-BCHCR和Super Fluor 647标记的BCHCR的表面结合仅在HJV敲除细胞中显著减弱（图2D和S2H）。全细胞裂解液western blot证实HJV敲除消除了EGFP-BCHCR结合（图2E和2F）。总之，这些结果表明HJV对BoNT/C结合并进入Neuro-2a细胞是必需的。

图2 筛选中鉴定候选基因的验证

（A）候选基因敲除细胞的流式细胞术荧光检测结果。（B）通过免疫印迹实验比较不同基因敲低细胞对BoNT/C的敏感性（BoNT/C：50 nM）。（C）（B）中灰度值的统计分析。数据表示为均值±标准差，p < 0.001，单因素ANOVA。（D）野生型和HJV敲除细胞中BCHCR（2 μM）结合的免疫荧光检测（标尺，25 μm）。（E和F）EGFP-BCHCR（2 μM）蛋白结合在对照组与HJV敲除细胞组之间的差异western blot分析。对（E）中灰度值的统计分析。数据表示为均值±标准差，p < 0.001，非配对t检验。（G和H）对照组与HJV敲除细胞中不同浓度BoNT/C摄取量的差异（L：10 nM；M：30 nM；H：50 nM）。数据为三次重复的平均值。

HJV过表达促进了BoNT/C在质膜上的结合

为明确HJV在BoNT/C与细胞表面结合中的调控作用，我们构建了pcDNA3.1-FLAG-HJV过表达质粒并瞬时转染至Neuro-2a细胞中，已验证可实现HJV的高效表达（图S3A和S3B）。细胞结合实验结果显示，EGFP-BCHCR与细胞膜的结合水平随FLAG-HJV转染呈剂量依赖性显著增加，从而确认了HJV表达与BoNT/C膜结合能力之间的正相关关系（图3A和3B）。

激光共聚焦显微镜的进一步观察发现，与对照组相比，HJV过表达细胞中EGFP-BCHCR的膜结合信号显著增强（图3C和3D）。同样，荧光显微镜和Western blot检测显示，过表达HJV的293T细胞中EGFP-BCHCR与细胞膜的结合显著增强（图3E、3F和S3C），这一发现也得到了过表达HJV的悬浮细胞系K562的分析支持（图S3D）。这些结果表明HJV负责EGFP-BCHCR与细胞膜的结合。

图3 HJV介导BoNT/C进入Neuro-2a细胞

(A) 在24孔板中瞬时转染pcDNA3.1-FLAG-HJV质粒48小时后，Western blot分析EGFP-BCHCR（2 μM）蛋白与Neuro-2a细胞的结合情况（L：1 μg/孔；H：2 μg/孔）。(B) 对(A)中灰度值进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.001，单因素方差分析。(C) 野生型细胞和HJV过表达细胞共孵育后EGFP-BCHCR（2 μM）细胞膜结合程度的比较（标尺，25 μm）。(D) 对(C)中灰度值进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.05，非配对t检验。(E) 293T细胞中FLAG-HJV与EGFP-BCHCR（2 μM）共定位的共聚焦分析（标尺，15 μm）。(F) 对(E)中均值进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.01，非配对t检验。(G) HJV基因敲除细胞中内化和酶解功能互补实验（L：10 nM；M：30 nM；H：50 nM）。(H) Western blot验证EGFP-BCHCR（2 μM）在HJV基因敲除细胞中的互补情况。(I) 对(F)中灰度值进行统计分析（n = 3）。数据以均值±标准差表示，p < 0.001，单因素方差分析。(J和K) HJV糖基化位点突变对EGFP-BCHCR（2 μM）结合的影响。数据以均值±标准差表示；数据为三次重复的平均值。

为进一步验证HJV在BoNT/C摄取中的作用，我们在Hjv?/? Neuro-2a细胞中进行了功能拯救实验。利用前间隔邻接基序（PAM）突变质粒瞬时恢复HJV表达后，我们分别通过EGFP-BCHCR膜结合实验和酶解实验评估了BoNT/C的结合和内化效率。结果显示，HJV拯救后BoNT/C对突触融合蛋白-1的裂解显著恢复，但对SNAP-25的裂解无明显变化（图3G）。这种差异可能源于BoNT/C裂解SNAP-25所需的酶活性阈值高于突触融合蛋白-1。此外，HJV拯救的Hjv?/?细胞中BoNT/C的结合能力在很大程度上恢复到了野生型细胞的水平（图3H和3I）。

值得注意的是，我们利用定点突变技术构建了两个糖基化缺陷突变体（N111A和N206A）（图S3E）。结果显示，HJV的糖基化修饰并未显著影响其与BoNT/C的结合（图3J和3K）。

HJV作为BoNT/C的结合受体

上述结果表明HJV是BoNT/C进入细胞的关键分子，通过介导BCHCR与质膜的结合发挥作用。为进一步阐明分子间相互作用，我们首先进行了共免疫沉淀（coIP）实验。结果证实目标蛋白EGFP-BCHCR与全长FLAG-HJV之间存在直接且特异性的相互作用，而对照蛋白EGFP与HJV之间则未观察到相互作用（图4A）。

图4 HJV的155–393氨基酸片段介导其与BCHCR的相互作用

(A) 使用coIP实验表征FLAG-HJV与EGFP-BCHCR的直接结合。(B) 全长HJV结构域组成示意图。(C) 使用coIP实验表征FLAG-HJV片段与EGFP-BCHCR的直接结合。(D) 对(C)中灰度值进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.001，单因素方差分析。(E) 使用Biacore表征GST-HJV（155–328 aa）与HCR的直接结合。(F) 使用coIP实验表征FLAG-HJV片段与EGFP-BCHCR和EGFP-BHCR（ΔWY）的直接结合。(G) 对(F)中灰度值进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.05，非配对t检验。(H) Western blot分析EGFP-BCHCR（2 μM）和EGFP-BCHCR（ΔWY：2 μM）在Neuro-2a细胞中的结合情况。(I) 对(H)中均值进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.05，非配对t检验。(J和K) 使用Biacore表征GST-HJV（155–328 aa）、EGFP-BCHCR和EGFP-BCHCR（ΔWY）之间的直接结合。

为精确绘制HJV结合BCHCR的关键区域，我们构建了一系列覆盖不同功能域的HJV缺失突变体。其中，40–93 aa区域含有RGD结构域，155–216 aa区域含有von Willebrand因子（vWF）D型结构域。FLAG标记的免疫荧光实验显示，所有设计的HJV截短体均可正常锚定于细胞表面，排除了结构截短导致异常定位的可能性，间接验证了截短体的正确折叠和功能完整性（图S3I）。随后的coIP实验结果显示，HJV的C端结构域（155–393 aa）是介导其与BCHCR相互作用的核心区域，而N端结构域（40–154 aa）不参与此结合过程（图4B、4C和4D）。

为确定HJV-BoNT/C的结合解离常数（KD）值，我们在大肠杆菌中重组表达了GST-HJV（155–328 aa）（图S3F）并进行Biacore亲和力测定。以GST蛋白作为阴性对照（图S3G），HJV与BCHCR之间的KD值估计为0.729 μM，其结合传感图见图4E。结果显示HJV在体外直接与BCHCR相互作用，呈现快结合、快解离的动力学特征。

考虑到BCHCR的Loop1和WY结构域是神经节苷脂的结合位点，不同于分布于突触前膜的神经节苷脂，HJV位于肌细胞膜上。两种受体很可能竞争结合毒素的同一结合区域。我们构建了编码缺失Loop1或WY环结构域的BCHCR的大肠杆菌表达质粒。由于双突变体（ΔLoop1/ΔWY）和ΔLoop1未能产生可溶性蛋白（图S3H），后续实验仅检测了WY环缺失突变体（图S3F）。coIP实验显示，WY环的缺失显著削弱了HJV与EGFP-BCHCR之间的相互作用（图4F和4G）。一致地，细胞结合实验证实WY环的缺失直接损害了BCHCR与细胞膜上HJV的结合（图4H和4I）。此外，Biacore亲和力检测显示，WY环截短后HJV片段（155–328 aa）对BCHCR的亲和力显著降低（图4J和4K）。显然，这些数据支持了WY环确实是HJV与BCHCR相互作用的关键结构。

综上所述，这些互补的证据均支持HJV作为BoNT/C的蛋白受体。

HJV介导BoNT/C的效力及其在小鼠中的组织特异性分布

尽管在细胞模型中获得了上述发现，本研究的一个局限是使用Neuro-2a细胞系时，需要暴露于超生理浓度（2 μM）的EGFP-BCHCR以确保成功的细胞染色，而该细胞系在酶解和受体结合方面的敏感性相对较低。为确定HJV在BoNT/C生理作用中的功能角色，我们使用重组BoNT/C对HJV基因敲除小鼠进行了挑战实验（图5A）。通过qPCR在心脏、骨骼肌和神经组织中确认了HJV的成功敲除（图S4A）。首先，通过小鼠指伸展评分（DAS）检测和生存分析评估BoNT/C敏感性。肌肉注射25 pg（0.4 mLD50）BoNT/C后，与野生型对照组相比，Hjv?/?小鼠的最大DAS评分（4级）持续时间缩短，随后DAS评分下降速度更快（图5B）。其次，腹腔注射150 pg（2.4 mLD50）BoNT/C后，Hjv?/?小鼠的毒素诱导致死率显著降低（图5C）。值得注意的是，免疫荧光分析显示BCHCR与野生型小鼠原代培养骨骼肌细胞的质膜存在显著结合。同时观察到BCHCR与HJV的共定位，而在Hjv?/?小鼠中则检测不到结合（图5D）。由于HJV在神经元中的表达量极低，来自Hjv?/?小鼠的原代培养海马神经元的BoNT/C摄取没有显著变化，提示独特的神经受体而非HJV可能在毒素进入神经细胞中不起主要作用（图S4B）。总之，上述结果支持了HJV在功能上对EGFP-BCHCR直接结合骨骼肌细胞是必需的这一结论。

图5 HJV基因敲除改变了BCHCR的体内分布并减轻了中毒进程

(A) DAS（肌肉注射）和系统性毒性检测（腹腔注射）示意图。(B) 左后脚趾瘫痪严重程度的DAS评分（n = 5，DAS ± SEM），p < 0.05，单因素方差分析。(C) 注射150 pg BoNT/C后野生型和Hjv?/?小鼠的生存曲线（n = 5），p < 0.05，单因素方差分析。(D) 原代培养肌管中EGFP-BCHCR（2 μM）与HJV的共定位分析（标尺，7.5 μm）。(E) 对(D)中共定位率进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.001，非配对t检验。(F) 野生型和Hjv?/?小鼠腓肠肌组织切片中EGFP-BCHCR（2 μM）结合差异。用Alexa Fluor 555标记的α-银环蛇毒素显示神经肌肉接头（标尺，50 μm）。右侧图像为左侧图像的缩小视图（标尺，10 μm）。(G) 对(F)中平均荧光强度进行统计分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.001，非配对t检验。(H) 68Ga-NOTA-BoNT/C-HCR（100 μg）在野生型和Hjv?/?小鼠中的PET/CT核成像结果；红色虚线圈：心脏，黄色虚线圈：肝脏。

为进一步调查HJV在BoNT/C于小鼠器官中分布的作用，我们使用正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）研究静脉注射后68Ga-NOTA-BoNT/C-HCR的生物分布。考虑到PET/CT体内成像依赖于放射性核素信号积累来实现靶点定位，因此需要给药微克级别的剂量以满足最低检测阈值。本研究中使用了100 μg的HCR。如图5H所示，在野生型小鼠的脑、脊髓、心脏、肝脏和膀胱中均观察到68Ga-NOTA-BoNT/C-HCR。相比之下，Hjv?/?小鼠心脏和肝脏中68Ga-NOTA-BoNT/C-HCR的蓄积显著减少（图5H）。此外，观察到的脑内信号强度增加可能归因于HJV基因敲除导致血脑屏障完整性受损。此前研究报道HJV主要分布于骨骼肌和心肌组织，我们的结果也显示原代肌肉细胞中HJV与BCHCR存在共定位（图5D）。我们随后系统地检测了BoNT/C HCR的组织分布。在野生型小鼠中，BCHCR广泛且丰富地分布于整个骨骼肌肌膜上，在用α-BTX共标记的神经肌肉接头处也能检测到明显的富集。重要的是，这种广泛的肌膜分布和BCHCR在神经肌肉接头处的显著蓄积在HJV缺失小鼠中被完全消除（图5F）。为调查骨骼肌中的阳性结果是否可归因于神经节苷脂，我们分析了骨骼肌组织中性神经节苷脂GT1b及其生物合成酶GALGT1的表达（图6A–6C）。结果显示，与原代培养海马神经元相比，GT1b在骨骼肌中几乎检测不到（图6C）。一致地，qPCR分析显示骨骼肌中未检测到Galgt1 mRNA，提示骨骼肌基本缺乏合成复杂神经节苷脂的能力（图6B）。值得注意的是，无论是否进行HJV基因敲除，Galgt1在海马中的表达水平均相当高，提示HJV基因敲除不影响神经元中神经节苷脂的表达，而后者被用作毒素受体。

这些观察结果表明，HJV对于BoNT/C在体内骨骼肌肌膜上的稳定结合和富集是必需的。

图6 神经节苷脂合成酶GALGT1和GT1b在不同组织和细胞中的表达水平

(A) 不同亚型神经节苷脂生物合成途径示意图。(B) 通过qPCR检测小鼠海马组织、骨骼肌和Neuro-2a细胞中神经节苷脂合成相关酶Galgt1?/?的表达水平。数据以均值±标准差表示，p < 0.001，非配对t检验。(C) 通过免疫荧光实验验证不同组织和细胞中神经节苷脂GT1b的表达（比例尺，10 μm）。

HJV同时作为BoNT/A的受体

为测试HJV是否对多种BoNT血清型起作用，本研究选择了临床使用最广泛的血清型BoNT/A。我们将野生型和HJV敲除细胞与EGFP标记的BAHCR片段（图S1B）进行孵育。Western blot分析显示，HJV敲除细胞中BAHCR结合显著减少（图7A和7B）。与此一致，使用荧光显微镜进行的细胞表面结合实验也表明，HJV缺失损害了BoNT/A的膜结合能力（图7C和7D）。对于酶切割活性实验，参照Dong等人的方法，用10和50 nM毒素处理细胞。与野生型对照组相比，全长BoNT/A处理后，HJV敲除细胞系中显示酶切割活性的毒素摄取量显著降低（图7E）。Biacore亲和力分析证实，重组HJV（155–328 aa）与BAHCR之间存在直接相互作用，估算结合亲和力约为0.269 μM（图7F）。

图7 HJV影响体内和体外BoNT/A中毒

(A和B) 对照细胞与HJV敲除细胞之间EGFP-BAHCR（2 μM）蛋白结合的Western blot分析。数据以均值±标准差表示，p < 0.001，非配对t检验。(C和D) 野生型和HJV敲除细胞中EGFP-BAHCR（2 μM）结合的差异（比例尺，25 μm）。数据以均值±标准差表示，p < 0.05，非配对t检验。(E) 对照细胞与HJV敲除细胞中不同浓度BoNT/A摄取量的差异（低浓度：10 nM；高浓度：50 nM）。(F) 使用Biacore表征GST-HJV（155–328 aa）与BAHCR的直接结合。(G) 左后脚趾瘫痪严重程度的DAS评分（n = 7，DAS ± SEM），p < 0.05，单因素方差分析。(H) 注射30 pg BoNT/A后WT和Hjv?/?小鼠的生存曲线（n = 7），p < 0.05，单因素方差分析。(I) WT和Hjv?/?小鼠中68Ga-NOTA-BoNT/A-HCR的PET/CT核素成像结果。数据为三次重复的平均值。

在动物实验中，与WT对照相比，DAS实验显示Hjv?/?小鼠瘫痪发作延迟且恢复加速（图7G）。同样地，在致死剂量挑战下，Hjv?/?小鼠表现出更长的生存时间和更高的生存率（图7H）。

为进一步探索组织分布机制，我们使用PET/CT分析了BAHCR在心脏和肝脏组织中的蓄积情况。BAHCR的分布与已报道的心脏和肝脏中HJV的表达密切相关，HJV敲除显著降低了BAHCR在这些组织中的富集水平（图7I）。总之，我们的结果表明，HJV作为BoNT/A的结合受体，参与调控其中毒过程。

我们还检测了HJV是否能结合其他毒素血清型（如BoNT/B和BoNT/F）的HCR结构域。Biacore结合实验显示，HJV与BFHCR之间的亲和力为6.155 μM，大约比BAHCR和BCHCR低一个数量级（图S6A）。对于BBHCR，2 μM浓度下的响应单位低于10（图S6B），该信号水平被认为过低而不可靠，表明BBHCR与HJV之间的结合可忽略不计。此外，在HJV敲除的Neuro-2a细胞中，BFHCR结合显著降低（图S6C和S6D）。HJV与HCR之间相互作用的差异明显与不同血清型HCR毒素中参与HJV互作的特异性氨基酸残基不同有关。

讨论

BoNT/C是BoNT家族中目前唯一尚未鉴定蛋白受体的血清型。虽然先前的研究提出神经节苷脂是介导BoNT/C细胞摄取的唯一受体，但它们的广泛表达缺乏严格的神经元特异性，无法解释BoNT/C对突触前运动神经元的高度趋性。此外，神经节苷脂与BoNT/C表现出低亲和力且可逆的弱相互作用，仅促进初始膜富集。相比之下，突触囊泡相关蛋白受体提供必需的高亲和力结合并触发内吞作用，赋予体内中毒所需的精确细胞选择性。此前研究表明，高钾刺激可增强BoNT/C的神经元摄取，提示存在一种蛋白类受体，可能定位于突触囊泡内。在本研究中，我们进行了无偏倚的全基因组CRISPR-Cas9筛选，鉴定出HJV作为BoNT/C和BoNT/A的非神经元蛋白受体（图1）。该蛋白通过毒素的HCR结构域促进细胞表面结合，具有快速的解离速率，从而介导毒素的后续内吞作用（图2、3、4E、5和7）。破坏HCR-HJV相互作用可强力抑制毒素内化。此外，HJV敲除导致EGFP-BCHCR与小鼠骨骼肌肌膜的结合显著减少，伴随瘫痪发作延迟、生存时间延长以及小鼠中毒力显著降低（图5和7）。这些在分子、细胞、组织和动物水平上的发现均支持HJV可能通过低亲和力结合局部肌膜来捕获BoNT并作为其在运动终板（NMJ）附近的储库，从而间接促进运动神经元中毒，而结合后的毒素可再次释放并被神经元中的高亲和力受体重新捕获。

本研究一个关键的意外发现是，与已鉴定的其他BoNT血清型蛋白受体不同，HJV不是突触或突触囊泡蛋白。这提示BoNT/A和BoNT/C的高效细胞摄取不仅由神经元受体介导，还由外周非神经元组织受体与神经元受体协同介导（图S4B）。在毒素摄取过程中，为使毒素高效递送至NMJ突触前膜，HJV可能在肌膜上特异性地捕获血液循环或组织间隙液中的毒素，从而间接提高NMJ局部的毒素浓度。该过程促进了NMJ运动神经元突触前膜上神经节苷脂和突触囊泡膜相关受体对毒素的识别，最终确保毒素的高效神经元摄取并发挥其毒性效应。对于BoNT/C，HJV主要介导其在骨骼肌中的结合和富集（图5），而其在神经元中的内吞作用不依赖于HJV，但依赖于一种尚未鉴定的神经元特异性蛋白受体（图S4B）。遗憾的是，在我们筛选出的前30个候选基因中，没有鉴定出神经元特异性蛋白受体。未来研究将采用邻近标记技术对原代培养的海马神经元进行实验，以鉴定BoNT/C的神经元受体。对于临床使用最广泛的血清型BoNT/A，本研究揭示HJV通过相同的预富集机制介导其在非神经元组织中的分布，随后被SV2蛋白内吞进入神经元。此外，HJV的组织表达谱提示，肌肉、心脏和肝脏等非神经元组织可能是BoNT/A的潜在靶器官（图7）。该发现为临床应用中所观察到的BoNT/A多组织趋性提供了潜在解释，并阐明了其非神经元副作用的潜在机制。HJV与不同毒素血清型结合的结构特异性差异也值得利用晶体结构分析等技术进行深入探究。

神经节苷脂是一类含有唾液酸的糖鞘脂，广泛分布于哺乳动物细胞膜中，在神经系统中高度富集。先前的研究表明，BoNT/C与其他血清型不同，其神经节苷脂结合位点存在差异，该毒素至少拥有位于WY环和Sia-1位点的两个神经节苷脂结合位点。在本研究中，共免疫沉淀和Biacore亲和力实验证实，HJV-BCHCR相互作用主要由HJV的C端结构域（残基155–393）和BCHCR的WY环共同介导（图4）。就空间分布而言，神经节苷脂主要位于运动神经末梢的突触前膜上，而HJV主要定位于肌细胞表面。在此，HJV结合BoNT/C并介导毒素富集，从而提高NMJ附近的局部毒素浓度。合理地推测，HJV充当关键的肌肉侧富集因子，与神经节苷脂形成空间互补和协同作用，最终增强BoNT/C在体内的功能效率。

HJV由HFE2基因（又称RGMc）编码，是铁代谢的关键调节因子，属于排斥导向分子（RGM）家族。成熟HJV蛋白通过Dsp393处的甘油磷脂酰肌醇（GPI）连接锚定于细胞膜，并通过BMP/Smad信号通路调节铁代谢。先前的工作表明，HJV具有高度的组织特异性，主要在骨骼肌、心肌和肝脏中高表达，而在脑组织和成熟海马神经元中检测不到。虽然Neuro-2a细胞通常被认为是神经元来源，但与海马神经元不同，它们表现出HJV的内源性表达（图S2I），如先前所报道。本研究鉴定HJV作为BoNT/A和BoNT/C的非神经元受体。鉴于其独特的分布，我们调查了HJV-毒素相互作用是否介导组织特异性趋性。PET/CT成像显示，放射性标记的BAHCR和BCHCR信号特异性定位在HJV富集的组织（如心脏和肝脏）中（图5和7），这与已确立的小鼠HJV表达谱一致。考虑到外周组织中HJV的高丰度，我们提出，全身给药的BoNT/A和BoNT/C可能在这些部位与传统神经元靶点之外的HJV发生相互作用。该相互作用可能将BoNT/A注射与通过HJV在肌膜上的结合导致的肌肉萎缩联系起来。此外，虽然NMJ是BoNT的主要作用位点，毒素通过抑制神经递质释放导致瘫痪，但我们的数据显示，BCHCR不仅分布至NMJ，还广泛分布至肌膜，与肌纤维结合并具有内吞潜力（图5）。这种肌纤维结合的生理意义仍有待阐明。最后，这些毒素对HJV富集组织的特异性亲和力为蛋白质工程提供了机遇，使得开发HCR结构域作为肝脏、心脏等类似器官治疗的靶向递送载体成为可能。

本研究的发现不仅打破了BoNT受体的血清型特异性限制，还重塑了我们对BoNT家族中毒机制的理解。基于HJV的组织分布特征，可优化BoNT/A的临床应用方案，实现个性化剂量调整和副作用监测。此外，开发HJV靶向的广谱解毒剂将为BoNT/A和BoNT/C中毒的紧急治疗提供替代策略。未来研究可进一步阐明SV2和HJV受体对BoNT/A的协同调节作用，以及HJV介导的毒素结合与铁代谢调控之间的潜在交叉干扰。这些努力将有助于为BoNT的临床转化建立更为全面的理论基础。

研究的局限性

尽管有上述发现，我们的研究仍存在一些局限性。Neuro-2a细胞中BoNT/C的内化作用（如SNARE切割所示）可能是超生理BoNT/C浓度所致的实验假象。在生理浓度下（如体内BoNT/C暴露期间），肌膜上的HJV是否不能内吞BoNT/C，而是促进局部BoNT/C浓度增加以提高运动神经元上的毒性效力，需要进一步的实验验证。虽然我们证实了HJV在肌细胞肌膜上捕获和富集BoNT/C，但缺乏毒素从肌细胞转运至运动神经末梢的直接动态视觉证据。未来研究将使用肌管-神经元共培养和离体NMJ实验来调查HJV结合毒素的转运和与运动神经末梢的空间偶联，为HJV介导的富集模型机制提供关键见解。

此外，还有一种可能性，即通过HJV介导的BoNT与肌膜的结合可能对肌肉产生直接影响，例如导致肌肉萎缩。HJV介导的这种非神经元病变可能在BoNT/C诱导的小鼠致死中发挥重要作用，这一方面值得进一步研究。

**资源可用性**

**主要联系人**
有关进一步信息和资源和试剂的请求，应联系主要联系人王东升教授（[e-mail]），并将由其满足。

**材料可用性**
本研究中生成的质粒和细胞系可通过主要联系人合理申请获得。

**数据和代码可用性**
- 本论文中报告的所有数据将由主要联系人在请求后共享。
- 本论文未报告原始代码。
- 重新分析本论文中报告的数据所需的任何附加信息可通过主要联系人获得。

**致谢**
本工作得到了国家自然科学基金（82073825）、甘肃省科技重点项目（22ZD6FA053）、兰州市城关区科技计划和人才创新创业项目（2024JSCX0024）以及中央高校基本科研业务费专项资金（lzujbky-2021-sp32）的资助。

**作者贡献**
概念化，D.W.；调查研究，W.M.、B.L.、J.G.、R.N.、Z.L.、W.W.、Yu Wang、G.N.、C.Z.、Yudong Wang、X.Y.、D.D.、X.M.、J.H.、Xiaoru Wang、F.Q.和Y.L.；可视化，W.M.、B.L.和J.G.；经费获取，D.W.；项目管理，W.M.和D.Z.；监督，D.W.、D.Z.和Xin Wang；初稿撰写，W.M.；修订和编辑，D.W.、D.Z.和Xin Wang。

**利益声明**
作者声明不存在竞争性利益。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|------------|------|--------|
| **抗体** | | |
| 兔抗Syntaxin-1 | ImmunoWay | Cat# YT5440; RRID: AB-3756662 |
| 兔抗SNAP-25 | 本文 | N/A |
| 兔抗β-actin | ImmunoWay | Cat# YT0099; RRID: AB-2885029 |
| 兔抗BAHCR | 本文 | N/A |
| 兔抗BCHCR | 本文 | N/A |
| 兔抗BFHCR | 本文 | N/A |
| 兔抗Flag | ImmunoWay | Cat# YM3809; RRID: AB-3752716 |
| 兔抗HJV | 本文 | N/A |
| 小鼠抗GT1b | Sigma | Cat# MAB5608; RRID: AB-827533 |
| **细菌和病毒株** | | |
| TOP 10感受态细胞 | Sangon | Cat# B528412 |
| BL21（DE3）感受态细胞 | Sangon | Cat# B528414 |
| DH-5α感受态细胞 | Sangon | Cat# B528413 |
| **化学品、肽和重组蛋白** | | |
| Super Fluor 647 | 北京荧光 | N/A |
| α-银环蛇毒素 | Biotium | Cat# 00018 |
| DMEM/高糖 | Cytiva | Cat# SH30022.01 |
| MEM | Procell | Cat# PM150410 |
| RPMI-1640 | Procell | Cat# PM150110 |
| B27 | Gibco | Cat# 17504044 |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | Cat# 35050–061 |
| FBS | Excell | Cat# FSP500 |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | Cat# P1400 |
| Polybrene | Solarbio | Cat# H87361 |
| 嘌呤霉素 | Solarbio | Cat# P8230 |
| 潮霉素B | Solarbio | Cat# B9300 |
| PEI | YEASEN | Cat# 40816ES01 |
| RIPA裂解缓冲液 | Solarbio | Cat# 20260309 |
| PMSF | Servicebio | G2008-1M |
| Ni-NTA 6FF（His-Tag） | 北京瑞达恒辉 | N/A |
| BAHCR | 本文 | N/A |
| EGFP-BAHCR | 本文 | N/A |
| BCHCR | 本文 | N/A |
| EGFP-BCHCR | 本文 | N/A |
| EGFP-BCHCR（Del WY LOOP） | 本文 | N/A |
| BBHCR | 本文 | N/A |
| BFHCR | 本文 | N/A |
| BoNT/A | 本文 | N/A |
| BoNT/C | 本文 | N/A |
| GST | 本文 | N/A |
| GST-HJV 155–328 aa | 本文 | N/A |
| **商业检测** | | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Solarbio | Cat# PC0020 |
| 基因组规模CRISPR敲除文库 | Addgene | Cat# 1000000049 |
| 基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | Cat# A1012A |
| M5 Easy-High EndoFree质粒 Maxi试剂盒 | Mei5Bio | Cat# MF985-01 |
| Rapid质粒DNA Mini试剂盒 | Simgen | Cat# 1005250 |
| **实验模型：细胞系** | | |
| HEK-293T | Procell | Cat# CL-0005 |
| Neuro-2a | Procell | Cat# CL-0168 |
| HT-22 | Procell | Cat# CL-0697 |
| K562 | Procell | Cat# CL-0130 |
| **实验模型：生物体/菌株** | | |
| C57BL/6J野生型小鼠 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | N/A |
| C57BL/6J Hjv?/?小鼠 | 王福地教授 | N/A |
| **寡核苷酸** | | |
| sgRNA HJV-F: CACCGCGCTCAGAGCGCAACCGCCG | 本文 | N/A |
| sgRNA HJV-R: AAACCGGCGGTTGCGCTCTGAGCGC | 本文 | N/A |
| sgRNA TFR2-F: CACCGTCGAAAGGCTGCCCCCTATC | 本文 | N/A |
| sgRNA TFR2-R: AAACGATAGGGGGCAGCCTTTCGAC | 本文 | N/A |
| sgRNA PLGRAKT-F: CACCGCTTCACCTACCAGTATGACC | 本文 | N/A |
| sgRNA PLGRAKT-R: AAACGGTCATACTGGTAGGTGAAGC | 本文 | N/A |
| sgRNA LRP3-F: CACCGACAGTGAACCTCTTTCTCAC | 本文 | N/A |
| sgRNA LRP3-R: AAACGTGAGAAAGAGGTTCACTGTC | 本文 | N/A |
| **重组DNA** | | |
| pCDNA3.1 | 丰辉生物 | Cat# BR039 |
| pET-28a | Sangon | Cat# A345179 |
| pGEX-4T-1 | 丰辉生物 | Cat# YH004 |
| pMD2.G | Sangon | Cat# A338961 |
| pSPAX2 | Sangon | Cat# A338972 |
| Lenti-Guide-Puro | Addgene | Cat# 52963 |
| Lenti-Cas9-Blast | Addgene | Cat# 104997 |
| Lenti-Guide-HJV-Puro | 本文 | N/A |
| Lenti-Guide-TFR2-Puro | 本文 | N/A |
| Lenti-Guide-PLGRKT-Puro | 本文 | N/A |
| Lenti-Guide-LRP3-Puro | 本文 | N/A |
| pcDNA3.1-Flag-HJV | 本文 | N/A |
| pcDNA3.1-Flag-HJV（RS） | 本文 | N/A |
| pcDNA3.1-Flag-HJV（Del 40-93aa） | 本文 | N/A |
| pcDNA3.1-Flag-HJV（Del 94-154aa） | 本文 | N/A |
| pcDNA3.1-Flag-HJV（Del 155-216aa） | 本文 | N/A |
| pcDNA3.1-Flag-HJV（Del 217-328aa） | 本文 | N/A |
| pcDNA3.1-Flag-HJV（Del 329-392aa） | 本文 | N/A |
| pET28a-BoNT/A | 本文 | N/A |
| pET28a-BoNT/C | 本文 | N/A |
| pET28a-BAHCR | 本文 | N/A |
| pET28a-BCHCR | 本文 | N/A |
| pET28a-BBHCR | 本文 | N/A |
| pET28a-BFHCR | 本文 | N/A |
| pET28a-EGFP-BAHCR | 本文 | N/A |
| pET28a-EGFP-BCHCR | 本文 | N/A |
| pET28a-EGFP-BCHCR（Del WY Loop） | 本文 | N/A |
| pGEX-4T-1-HJV（155-328aa） | 本文 | N/A |
| **软件和算法** | | |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | https://www.graphpad.com |
| ImageJ | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| SPSS | SPSS 19.0 | https://www.ibm.com/products/spss-statistics |
| LAS-AX | LAS-AX 1.1 | https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/products/microscope-software |
| Snap Gene Viewer 4.2.11 | GSL Biotech LLC | https://www.snapgene.com/ |
| **其他** | | |
| BD FACS Aria II | BD Biosciences | N/A |
| STELLARIS 8 STED | Leica | N/A |

**实验模型和研究参与者细节**

**细胞培养**
293T和HT-22细胞在含有10% FBS（Excell, FSP500）和1%抗生素（Solarbio, P1400）的DMEM高糖培养基（Cytiva, SH30022.01）中培养。Neuro-2a细胞在含有10% FBS（Excell, FSP500）和1%抗生素（Solarbio, P1400）的MEM培养基（Procell, PM150410）中培养。K562细胞在含有10% FBS和1%抗生素的RPMI-1640培养基（Procell, PM150110）中培养。所有培养均在37°C、5% CO?条件下进行，细胞使用第4至20代的细胞。HT-22和Neuro-2a细胞使用Sanger测序进行鉴定。通过PCR常规筛查支原体污染，所有培养物均确认无支原体。所有细胞均来自Procell。

大鼠海马神经元按照先前描述的方法从E18-19胚胎中制备。简而言之，分离的海马在37°C下用胰蛋白酶解离40分钟。细胞接种在聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，在含有1% B27（Gibco, 17504044）和Glutamax（Thermo Fisher Scientific, 35050-061）的Neurobasal培养基中培养。实验通常在进行10-14天（DIV，培养天数）时进行。

**动物**
本工作中的所有动物实验均经兰州大学实验室动物福利和伦理委员会批准（批准号：2020–03-10），并按照其指南进行。所有小鼠在笼中饲养，温度为20°C至26°C，湿度为40%至60%，12:12光照-黑暗周期。小鼠可在笼中自由走动，并自由获取食物和水。C57BL/6J小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所。C57BL/6J Hjv?/?小鼠由浙江大学王福地教授惠赠。所有实验均使用6-8周龄雄性小鼠。每个实验使用的动物数量在相应的方法部分中指定。

**方法细节**

**蛋白质纯化**
编码BoNT/C（GenBank: LC759602.1）和BoNT/C HCR（范围：866-1291aa）的基因由金斯瑞生物科技股份有限公司（中国）合成，分别克隆到pET28a+或pcDNA3.1中。重组His6-BoNT/C、His6-EGFP-BCHCR、His6-BCHCR和His6-EGFP-BAHCR在大肠杆菌BL21(DE3)（Sangon, B528414）中表达。细胞在含有500 mL LB培养基的1 L带挡板锥形瓶中，于37°C、200 rpm振荡培养。当培养物在600 nm处的光密度达到0.6至0.8时，用0.2 mM IPTG诱导目标基因表达。细胞在8000 rpm下离心5分钟收集，并于?80°C保存。细菌在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、300 mM NaCl和20 mM咪唑的结合缓冲液中通过超声破碎。裂解物在4°C、10,000 rpm下离心10分钟，并通过Ni2?亲和层析纯化，目标蛋白在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、300 mM NaCl和500 mM咪唑的洗脱缓冲液中收集。

为生成BoNT的双链形式，蛋白在4°C下用凝血酶（每毫克蛋白2 U）过夜消化。消化产物在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl的缓冲液中通过分子排阻层析纯化。收集目标峰分数，并使用50 kDa分子量截留值的Vivaspin超滤装置浓缩。浓缩样品随后用内毒素去除树脂处理，然后通过0.22 μm滤器进行无菌过滤。最后，纯化的蛋白分装并在?80°C保存。

GST-HJV 155–328-His6基因根据NCBI参考序列（NM_027126.5）上的氨基酸序列，经大肠杆菌密码子偏好性优化后完全合成。通过EcoR I酶切插入到pGEX-4T-1中。His6标签融合在3′端，以便在结合缓冲液中50 mM高咪唑条件下通过Ni2?亲和层析进行纯化。所有获得的蛋白在含有150 mM NaCl的20 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中进行透析。最后，蛋白在液氮中快速冷冻并在?80°C保存备用。

**流式细胞术分析**
对于FACS分析，细胞用PBS洗涤三次，并用0.005%胰蛋白酶收获。Neuro-2a细胞洗涤并用MEM培养基调整至每毫升1 × 10?个细胞。在4°C下向细胞悬液中加入指示浓度的EGFP-HCR，孵育6小时。在1500 rpm下离心5分钟后，用冰冷的PBS洗涤两次，并重悬于含有3% FBS的FACS缓冲液（PBS）中。结合EGFP-HCR并显示绿色荧光的细胞使用BD Bioscience的FACS（BD FACSAria II）和FACSchorus软件（BD Bioscience）测量，分析1 × 10?个细胞。

**CRISPR/Cas9筛选**
使用Lenti-Cas9-Blast（Addgene #104997）生成Neuro-2a-Cas9细胞，并在15 μg/mL潮霉素B存在下筛选。Lenti-CRISPRv2单链导RNA（sgRNA）半文库A和B（Addgene #1000000052）从Addgene获得，并分别独立包装成慢病毒文库。Neuro-2a细胞以感染复数（MOI）为0.5被sgRNA慢病毒文库转导。在培养基中加入1 μg/mL Polybrene以促进sgRNA慢病毒转导。孵育12小时后，感染细胞用1 μg/mL嘌呤霉素筛选。将至少3.5 × 10?个亚文库A和亚文库B细胞接种在四个15厘米培养皿中，以确保足够的sgRNA覆盖度，每个sgRNA约代表500次。这些细胞用作第0轮样品。

转染GeCKO文库的细胞用PBS洗涤三次，并用0.005%胰蛋白酶收获。在4°C下向细胞悬液中加入指示浓度的EGFP-BCHCR，孵育6小时。在1500 rpm下离心5分钟后，用冰冷的PBS洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中，然后使用BD FACSAria III进行分选，FITC-H强度至少为20%。分选后的细胞培养5天，然后以相同方式进行后续分选，直到FITC值保持恒定。细胞扩增并收获，用商业基因组DNA提取试剂盒提取最后一轮分选细胞的基因组DNA。通过PCR扩增含有sgRNA序列的DNA片段。下一代测序在上海金斯瑞生物科技股份有限公司进行。使用基于模型的基因组范围CRISPR/Cas9敲除分析（MAGeCK）进行数据分析，以识别与未经EGFP-BCHCR处理的细胞相比，结合EGFP-BCHCR显著减少的细胞中富集的gRNAs。

**建立敲除细胞系**
为生成Neuro-2a相对目标基因敲除细胞，首先将sgRNAs克隆到Lenti-CRISPR-V2载体中以靶向指示基因。然后通过共转染含有sgRNA的Lenti-CRISPR-V2、psPAX2和pMD2.G到293T细胞中产生慢病毒。最后，Neuro-2a细胞用含有目标sgRNA的慢病毒转导，然后用1 μg/mL嘌呤霉素筛选。所得单克隆细胞在上海金斯瑞生物科技股份有限公司（中国苏州）通过测序验证。

**共免疫沉淀实验**
转染HJV-Flag的293T细胞在IP裂解缓冲液（Servicebio, G2038）中裂解，补充100 mM PMSF蛋白酶抑制剂，在4°C下处理10分钟。裂解物在15,000 g、4°C下离心10分钟，并通过BCA试剂盒（Solarbio, PC0020）测定蛋白浓度。将10 μg EGFP-BCHCR加入到500 μg裂解物上清液中，混合物在4°C下与抗GFP纳米抗体琼脂糖珠（AlpaLifeBio, KTSM1301）孵育2小时。珠子用IP裂解缓冲液洗涤两次，结合的蛋白通过煮沸用SDS样品缓冲液洗脱。目标蛋白通过使用抗Flag和抗BCHCR抗体进行免疫印迹检测。

**Western blot分析**
对于酶切割活性测定，细胞按Dong等人描述的方法用10 nM和50 nM毒素处理。在细胞结合实验中，细胞与2 μM EGFP-BCHCR在37°C下孵育30分钟，然后用冰冷的PBS洗涤三次，从板底刮下，并用含有PMSF的RIPA缓冲液裂解。从细胞沉淀中获取全细胞蛋白提取物，总蛋白样品与5×上样缓冲液混合并在100°C下煮沸5分钟。样品通过SDS-PAGE分离，并半干电转移至0.2 μm PVDF膜上。膜用TBST缓冲液中的5% BSA在室温下封闭1小时，免疫印迹使用一抗在4°C下过夜进行。用TBST洗涤后，HRP标记的二抗在室温下孵育1小时。条带在Tanon凝胶成像系统（4600SF，Tanon，上海，中国）上显影，数据用ImageJ软件分析。

**免疫荧光染色**
小鼠经颅灌注20 mL PBS，随后用15 mL 4% PFA灌注。组织分离并在4°C下用4% PFA持续固定过夜，然后用PBS洗涤三次。固定组织最后在4°C下置于含有30%蔗糖的PBS中进行冷冻保护3天，包埋于OCT复合剂（Biosharp, BL557A）中，速冻并在?80°C保存。将10 μm厚的冷冻切片贴附于载玻片上，浸泡于PBS中，并用PBS中的10% BSA封闭。骨骼肌切片用PBS中的0.6 mg/mL EGFP-BCHCR在室温下过夜孵育。然后洗涤并用CF?555 α-银环蛇毒素（Biotium, 00018）在室温下孵育15分钟。用PBS洗涤后，载玻片用DAPI（Yeasen, 40731ES10）再染色15分钟，再次洗涤后用Fluoromount-G（Yeasen, 36307ES08）封片。

共聚焦成像通过 Leica STELLARIS 8 显微镜获取（40× 水浸物镜，LAS-AX 软件），激发波长为 405、488、555、662 nm，使用 HyD 探测器进行检测。所有荧光定量分析中，对照组的平均荧光强度作为内部参考标准，过表达或敲除条件下细胞的平均荧光强度值据此进行归一化处理以进行比较。

小鼠趾外展评分测定（DAS）
C57BL/6J 野生型（wt）小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所。C57BL/6J Hjv?/? 小鼠由浙江大学王福迪教授实验室提供，最初由 Chen 等人构建并报道。动物被随机分为实验组，按指定剂量接受 BoNTs 给药或不予处理。简要而言，将 BoNT/A（n = 7）和 BoNT/C（n = 5）注射至小鼠左腿腓肠肌内。由两名对处理方案不知情的观察者每天评估并记录趾外展评分，持续约 15 天。

小鼠 BoNTs 毒性实验
将 20–22 g 的 C57BL/6J 野生型和 C57BL/6J Hjv?/? 雌性小鼠随机分为两组，分别腹腔注射 150 pg BoNT/C（n = 5）或 30 pg BoNT/A（n = 7），溶于 100 μL 20 mM PB 缓冲液（pH 7.4）中，或不予处理。每 24 小时监测死亡率，并采用 Kaplan-Meier 分析生成生存曲线，比较实验组与对照组之间的致死动力学差异。

PET/CT 核成像
将 HCR 与 p-SCN-Bn-NOTA 以 10:1 的摩尔比混合于 1 mL 溶液中，室温下螯合 2 小时，随后用 1 N HCl 将 pH 调至 8.70。透析去除游离螯合剂后，得到 NOTA-HCR（A 型和 C 型）。为获取 ??Ga 溶液，向 ??Ge/??Ga 发生器洗脱液的峰段中加入 0.1 M NaOH 调节 pH 至 5.0。将 500 μg NOTA-HCR 加入 500 μL 含 130 MBq ??Ga 的溶液中，于 37°C 孵育 15 分钟，制备得到 ??Ga-NOTA-HCR。

成像在小动物 PET/CT 系统上完成（Madic Technology Co., Ltd., 中国）。向 Hjv?/? 小鼠尾静脉注射 15 MBq 的 ??Ga-NOTA-HCR（100 μg）。将小鼠以氧气中 2%–3% 异氟烷麻醉后，俯卧位放置于扫描架中，进行 10 分钟 PET 采集，随后进行 10 分钟 CT 扫描。图像数据处理使用 POMD 分析软件完成。所有 PET-CT 图像均在尾静脉注射 HCR（每只小鼠 100 μg）后 90 分钟，通过同步采集 20 分钟获取。

定量与统计分析
统计分析使用 SPSS 19.0 软件进行。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）将多种处理与单一对照组进行比较。两组之间的比较采用双尾非配对 Student's t 检验。数据以均值 ± 标准误（SEM）或均值 ± 标准差（SD）表示。差异在 ?p < 0.05、??p < 0.01、???p < 0.001 水平时被认为具有统计学意义。

补充信息（3）
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PDF (2.28 MB) Document S1. Figures S1–S6
PDF (5.79 MB) Data S1. Western blot 原始数据，涉及图 2–4、7、S1–S4 和 S6
PDF (18.32 MB) Document S2. 文章正文及补充信息