人外周血γδ T细胞从1岁至90岁的单细胞转录组参考图谱揭示成年期前的主要变化

《Cell Reports》：Single-cell transcriptomic reference map of human peripheral blood γδ T cells from 1 year to 90 years reveals major changes before adulthood

： γδ T细胞具有非传统的生物学特性，它们在胸腺中发育为功能细胞，随后适应出生后的环境信号，并在外周血中持续存在至成年期。单细胞转录组学技术使得研究人员能够在健康和疾病状态下探究γδ T细胞效应功能的潜在分子程序。然而，年龄因素的影响常常被低估，且针对年轻健康个体的对照转录组数据集十分稀缺。在本研究中，研究人员构建了一个经济高效的人外周血γδ T细胞单细胞转录组参考图谱，涵盖来自223名年龄介于1岁至90岁个体的106,711个细胞，并改善了婴儿期、儿童期和青春期的覆盖度。分析结果显示，γδ T细胞最显著的组成和转录变化发生在成年期之前，随后主要状态在成年期保持相对稳定。综上所述，本研究提供了一个健康个体单细胞转录组资源，为未来研究人类γδ T细胞在各种疾病中的作用奠定了基础。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

年龄是决定免疫系统组成和T细胞反应性的关键因素。在婴儿期，T细胞库由胸腺新T细胞的输出和首次抗原暴露所塑造，需要在病原体防御和环境耐受之间取得关键平衡。进入青春期直至成年期，胸腺输出和新抗原接触减少，而免疫记忆增加，这一转变反映了从免疫发育向免疫维持的过渡。在晚年和老年期，免疫功能下降，表现为慢性低度炎症、初始T细胞及T细胞功能减退、免疫调节受损，从而增加对感染、癌症和其他疾病的易感性。然而，人类外周血γδ T细胞从婴儿期到老年期的成熟和衰老过程此前仍缺乏系统性的认识，尤其在婴儿和儿童中，由于生物样本的有限可及性，通过单细胞转录组技术获取γδ T细胞十分困难。

人类γδ T细胞是一类表达由γ链和δ链组成的异二聚体T细胞受体（TCR）的非传统T淋巴细胞亚群。Vδ2和Vδ1 T细胞是两大主要亚群，具有不同的个体发育起源、组织分布和年龄动态。尽管已有两项外周血单核细胞（PBMC）研究专门分析了γδ T细胞，其中一项聚焦于成年期，另一项覆盖从婴儿期到老年人，但它们一致观察到年龄相关的组成变化，包括初始Vδ1 T细胞随年龄减少和效应Vδ1 T细胞增加，然而从婴儿期到老年人的人外周血γδ T细胞的系统性转录组特征描述仍然有限。因此，本研究旨在构建一个覆盖全生命周期、资源高效的人外周血γδ T细胞单细胞转录组参考图谱。

二、研究内容与总体结论

研究人员通过整合新生成的数据集与经过质量控制筛选的公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）资源，构建了涵盖223名年龄从1岁至90岁个体的106,711个外周血γδ T细胞的转录组参考图谱。该图谱实现了对婴儿、儿童、成人和老年人中γδ T细胞亚群的高分辨率系统表征。研究揭示，γδ T细胞转录组以青春期前的显著变化为特征，随后在成年期保持相对稳定。该数据集已公开可用，为研究人类γδ T细胞在健康和疾病中的生物学提供了经济有效的框架。

三、主要关键技术方法

研究人员首先重新分析了多个公共PBMC scRNA-seq数据集，依据TCRδ基因（TRDV1、TRDV2、TRDV3、TRDC）表达提取γδ T细胞，并设定每个供体至少100个γδ T细胞的纳入阈值，最终从Terekhova等研究的317个供体中保留143个、从Wang等研究的220个供体中保留48个。同时，研究人员利用10x Genomics 5′ scRNA-seq技术新生成来自幼儿、儿童、青少年和健康成人的外周血γδ T细胞数据集，以补充早期生命阶段的年龄覆盖。所有数据集通过Harmony算法进行批次效应校正和整合。此外，研究还采用了Monocle3和Slingshot进行Vδ1 T细胞的拟时序轨迹分析，使用Seurat FindMarkers进行年龄组间差异基因表达分析，利用clusterProfiler进行基因本体（GO）富集分析，并通过流式细胞术和体外HMBPP刺激实验验证GZMK? γδ T细胞的功能特征。样本来源包括汉诺威医学院的幼儿、青少年、健康成人献血者、RESIST老年个体队列及健康新生儿脐带血。

四、研究结果

1. 1.
   公共及新生成的人外周血γδ T细胞数据集的选择与整合

研究人员评估了多个公共PBMC scRNA-seq数据集，发现许多供体中γδ T细胞数量过少，且部分使用10x Genomics 3′化学方法的数集对TCRδ基因捕获不佳。基于广泛年龄覆盖和充足γδ T细胞数量的标准，最终保留了Terekhova等研究的143个供体和Wang等研究的48个供体，并纳入先前发表的儿童FACS分选γδ T细胞数据集。为改善早期生命阶段的年龄覆盖，研究人员新生成了幼儿、儿童、青少年和健康成人的数据集。整合前，细胞按数据来源明显分离；经Harmony校正后，不同数据集的细胞显著混合，同时保留了γδ T细胞状态的主要生物学组织。局部逆辛普森指数（LISI）评分在整合后显著提高，证实了数据集特异性效应的有效降低。

1. 2.
   从婴儿期到成年期外周血γδ T细胞主要亚群的鉴定

研究人员鉴定了十个γδ T细胞聚类，基于TCR使用、转录因子、趋化因子受体和效应分子的表达进行注释。根据TCF7、LEF1、GZMA和KLRK1表达，聚类分为初始聚类（c1–c4）、效应聚类（c5–c6和c8–c10）及一个混合聚类（c7）。初始聚类主要为Vδ1 T细胞，包括c1（CCR9高表达SOX4高表达）、c2（SOX4高表达）、c3（CCR7高表达SELL高表达）和c4（GZMK中等表达）。效应聚类包括c5（KLRC2高表达GZMK高表达Vδ1为主）、c6（KLRC2高表达KLRF1高表达GZMB高表达Vδ1为主）、c8（CCR6高表达DPP4高表达GZMK高表达Vδ2）、c9（KLRC1高表达GZMK高表达Vδ2）和c10（KLRC1高表达GZMB高表达Vδ2）。聚类c8以CCR6、RORC、CXCR6和ZBTB16高表达为特征，与早期生命外周血和胎儿胸腺中描述的3型样γδ T细胞一致；聚类c7以CCR4和CD4表达为特征，与早期生命中的2型样γδ T细胞一致。

1. 3.
   外周血γδ T细胞的组成变化主要发生在成年期之前

研究人员将所有样本分为11个年龄组（A–K），发现初始聚类（c1–c4）和中间聚类c7在青春期（E组，15–18岁）前急剧下降，而1型免疫效应细胞（c5–c6和c9–c10）累积。CCR4中等表达GZMK中等表达的c7聚类在婴儿期（A–B组，1–3岁）丰度最高，此后保持稳定。CCR6高表达GZMK高表达Vδ2聚类（c8）在儿童期和青春期达到峰值，此后快速下降并在老年期稳定维持。从F组（25–34岁）起，大多数聚类的频率趋于稳定，但效应Vδ1 T细胞（c5和c6）持续扩增，在老年人（K组，75岁以上）中丰度最高。这些趋势在不同数据集中具有可重复性，包括对Gong等纵向成人PBMC队列的独立验证。

1. 4.
   CCR9?SOX4? Vδ1 T细胞与不同的转录状态相关联

CCR9高表达SOX4高表达Vδ1聚类（c1）在最年轻的年龄组中最为丰富，在成年期变得罕见。c1细胞特异性表达CCR9，同时高表达SOX4、TCF7、LEF1、TCF12、ID3和LCK等与近期胸腺输出相关的基因，以及LAT、LTB、TRAF3IP3、RHOH和CD27等参与胸腺细胞存活和谱系定型的基因。拟时序分析将c1置于早期位置，并连接到两个主要的转录轴：路径1（c1→c2→c4→c5→c6）显示细胞毒性程序的逐步获得，路径2（c1→c2→c3）保留初始转录特征并逐步上调组织归巢和存活相关基因。沿两条轴的拟时序分布均显示清晰的年龄转移，年轻个体细胞富集于早期阶段，老年个体细胞主导后期阶段。

1. 5.
   GZMK? γδ T细胞显示效应前体特征并在激活后获得GZMB?Perforin?细胞毒性程序

流式细胞术分析显示成人PBMC中γδ T细胞分为GZMK阳性（GZMB阴性至中等表达）和GZMK阴性（GZMB中等至高表达）两群。GZMK阳性γδ T细胞显著高表达CD27、CD28、CD69和CD127，低表达CD16和Perforin。转录组比较显示，GZMK高表达聚类（c5、c8和c9）富集TCF7、IL7R、CD27、CD28、LTB、AP-1因子（FOS、JUNB、JUN）和NFKBIA等效应前体相关基因；GZMB高表达聚类（c6和c10）富集PRF1、GNLY、FCGR3A、KLRD1等高度细胞毒性相关基因，以及组织运输、抗病毒活性和先天激活相关基因。CD28被确认为分离GZMK? Vδ2 T细胞的可靠表面标志物。FACS分选的CD28? Vδ2 T细胞在基线时主要为GZMK阳性，经3天HMBPP体外刺激后，GZMK阳性细胞减少而GZMB高表达细胞增加，伴随Perforin表达升高和CD27表达降低。GZMK高表达Vδ1和Vδ2 T细胞在生命中较早出现，而GZMB高表达细胞出现较晚；胎儿和儿童胸腺数据集中仅鉴定到GZMK高表达γδ T细胞，足月新生儿脐带血中GZMK? γδ T细胞可检测到而GZMB?细胞几乎缺失。

1. 6.
   成年期前人外周血γδ T细胞的转录变化以发育和线粒体程序减少及效应相关特征增强为特征

研究人员在年轻（A–C组）和老年（I–K组）个体间进行差异基因表达分析，鉴定出179个上调和335个下调基因。下调基因富集于线粒体功能，包括线粒体核糖体小亚基和大亚基（MRPS和MRPL）、三羧酸循环酶、氧化磷酸化复合物和活性氧反应基因。γδ T细胞成熟相关基因（LEF1、CD27、IL7R、SOX4、TCF7、LTB、ID3、CCR7、RHOH、LCK、RELB、RHOG、CD7、MYC、CCR9、LAT）表达下降。上调基因富集于激活（HLA-DRB5、CD160、CD81、ZEB2、CD69）、迁移（ITGA4、ITGB2、CX3CR1、CXCR4、PREX1、TMSB10）、炎症反应（NFKBIZ、ZBP1、TNFRSF1B、ALOX5AP）和细胞毒性（PRF1、GZMB、GNLY、KLRK1）相关基因。抗凋亡基因（BCL2、MCL1、CFLAR）和AP-1转录因子（JUN、JUNB、JUND、FOS、FOSB、FOSL2）也升高。这些趋势在多个独立数据集中一致。

五、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，γδ T细胞在群体水平上，初始Vδ1 T细胞随年龄增长显著收缩，而效应Vδ1 T细胞扩增；Vδ2 T细胞在儿童期达到峰值并在成年后期下降。γδ T细胞的基因表达谱从高发育基因表达特征转变为与激活、细胞毒性、炎症和抗凋亡相关的特征，同时伴随线粒体相关基因表达减少，这是免疫衰老和炎症性衰老的标志。组成和转录变化主要在青春期前建立，成年期变化最小。这可能源于γδ T细胞独特的发育起源和成熟程序：作为胎儿胸腺中最早发育的T细胞之一，γδ T细胞在出生后不久经历扩增和功能成熟，包括获得GZMB、Perforin和NKG2D等细胞毒性分子。CCR9?SOX4?细胞亚群在婴儿和儿童中特异性丰富，轨迹分析提示其与组织迁移和颗粒酶产生亚群相连，其年龄相关变化可能反映了早期生命相关胸腺输出减少。GZMK高表达细胞具有效应前体特征，可视为处于激活响应状态、准备获得细胞毒性程序。

研究结论为：本研究提供了年龄分辨的人外周血γδ T细胞参考图谱，改善了婴儿期、儿童期和青春期的覆盖度，可作为未来探索γδ T细胞在各种感染性疾病和癌症中作用的“健康对照数据集”资源。研究局限性包括仅关注外周血而未涵盖多组织数据、未覆盖1岁以内婴儿、各年龄组样本量不均、种族元数据不完整以及性别分布不均限制了性别相关差异的系统评估。