蜜蜂作为环境全氟和多氟烷基物质（PFASs）污染的生物指示物及其对肠道微生物群落的潜在影响

《Insects》：Honey Bees as Bioindicators of Environmental PFASs Contamination and Potential Effects on Gut-Microbial Communities

　　

摘要专业翻译 蜜蜂（Apis mellifera）因其广泛的觅食范围和暴露于多种生物及非生物胁迫因素，是评估环境污染的有价值的生物指示物。本研究评估了利用蜜蜂作为生物指示物，在不同暴露风险水平（高、中、低）区域检测全氟和多氟烷基物质（PFASs）的可行性，以及PFASs对肠道微生物群落的潜在影响。研究人员将检测PFASs和农药残留的分析化学方法与分子及宏基因组分析相结合，以鉴定常见蜜蜂病原体并表征肠道微生物群落。短链PFASs在所有区域中均占主导地位，尤其是在高风险区域，而农药残留仅在少数蜂场中被检出。分子分析揭示了多种广泛存在的病原体，而宏基因组学分析显示肠道微生物组相对稳定，主要由乳杆菌属（Lactobacillus）、巴尔通体属（Bartonella）、 Bombilactobacillus属、斯诺德格拉斯氏菌属（Snodgrassella）、吉利亚梅拉菌属（Gilliamella）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）组成。然而，高风险与低风险PFAS暴露蜂场之间的微生物群落组成存在显著差异。这些结果支持蜜蜂作为环境PFAS监测的有效生物指示物，并提示PFAS暴露可能与蜜蜂肠道微生物群落的改变相关。需要进一步研究以阐明PFASs对蜜蜂毒性、肠道微生物群组成及整体健康的影响。

论文解读

一、研究背景与意义

蜜蜂（Apis mellifera）是至关重要的传粉昆虫，在维持全球生态系统和生物多样性中发挥着关键作用。然而，近几十年来，全球范围内蜜蜂种群数量持续下降，这一现象源于蜜蜂与自然环境的持续直接互动，以及多种非生物和生物胁迫因素的共同作用。非生物因素包括气候变化、集约化农业和单一栽培、农药的广泛使用以及环境污染物暴露；生物因素则包括瓦螨（Varroa destructor）和残翅病毒（DWV）等寄生虫和病原体对蜜蜂健康的严重损害。

环境污染是严重威胁蜜蜂及其他传粉昆虫的公认非生物因素。尽管农药对蜜蜂健康的影响已被广泛研究，但对所谓"新兴污染物"的影响知之甚少。全氟和多氟烷基物质（PFASs）因其环境持久性、广泛分布和潜在毒性而引发高度关注。PFASs是自20世纪40年代首次合成的合成分子，具有疏水亲脂的碳链结构，其中部分或全部碳原子上的氢原子被氟原子取代。根据官能团的不同，PFASs可分为多种类别和亚类，主要区分为"长链"或"遗留"PFASs与"短链"或"替代"PFASs。由于其强C–F键带来的高化学和热稳定性，PFASs被广泛用于纺织品涂层、表面活性剂、农药、食品接触包装、消防泡沫和化妆品中，因而在环境中具有极强持久性，被称为"永久性化学品"，并可在动物和人类组织中发生生物蓄积。

在意大利，PFAS环境监测计划由国家环境保护系统（SNPA）协调，由大区环境保护局（ARPAs）地方实施。威尼托大区根据PFAS在环境和水中基质中的存在情况及估计暴露水平，被划分为四个暴露区：红色区（最高PFAS浓度和最大健康关注）、橙色区（对可能受污染的私人水井和取水口的警示）、黄色区（加强水质监测）和绿色区（仅在特定环境基质中检测到非临界水平的PFASs）。这些暴露区为利用生物基质（包括传粉昆虫尤其是蜜蜂）进行生物监测研究提供了有价值的框架。

蜜蜂在PFAS环境风险评估中的便利性体现在多方面：蜜蜂可在广泛地理区域饲养，其暴露模式和污染物生物蓄积高度依赖当地环境条件；工蜂通常在蜂巢周围2–3公里半径内觅食，使其成为局部环境污染的有效生物指示物；觅食后，蜜蜂将花蜜、花粉、水及收集到的污染物运回蜂巢，这些物质在蜂蜡和蜂蜜等蜂巢产品中积累。与哺乳动物类似，蜜蜂可通过经口摄入受污染的水、花蜜和花粉、外骨骼直接接触以及空气暴露等途径接触环境污染物。在毒代动力学方面，肠道是负责吸收的主要器官，也是与外源物质相互作用的第一位点。

在人类中，PFAS暴露主要通过经口途径发生，包括受污染的饮用水、食物和室内灰尘。在胃肠道内，PFASs与肠道环境相互作用，影响其生物利用度和毒性。肠道微生物群是调节人类健康的关键因素，在代谢、免疫功能、氧化稳态中发挥基础作用，并通过在吸收前后与外源物质相互作用而关键性地影响污染物毒性。许多外源物质已被证明能显著影响肠道细菌群落组成，常导致菌群失调和氧化应激。与哺乳动物一样，蜜蜂的肠道微生物群在健康中发挥重要作用，影响发育、行为、营养、免疫功能和解毒，并保护宿主免受病原体侵害。环境污染物暴露也是肠道微生物群失调的重要驱动因素，但PFAS暴露对蜜蜂健康和肠道微生物群的影响在很大程度上尚未被探索。

因此，本研究的目标是：利用蜜蜂作为生物指示物评估意大利威尼托大区不同暴露风险区域蜂场的环境PFAS污染状况，并研究PFAS暴露对蜜蜂肠道微生物群组成的影响。

二、主要关键技术方法

研究人员在威尼托大区选取了15个蜂场，根据ARPAV监测数据中PFOA、PFOS、全氟壬酸（PFNA）和全氟己烷磺酸（PFHxS）的综合浓度，将蜂场划分为高暴露组（红色区，56–740 ng L^?1，7个蜂场）、中暴露组（黄色区，5–50 ng L^?1，4个蜂场）和低暴露组（棕色区，0.9–6 ng L^?1，4个蜂场）。2024年7月采集了每个蜂场约300只采集蜂。主要技术方法包括：采用液相色谱–串联质谱法（LC–MS/MS）结合同位素稀释和改良QuEChERS提取方法检测14种PFASs；采用液相和气相色谱串联三重四极杆质谱法（LC–MS/MS和GC–MS/MS）筛查292种农药残留；采用聚合酶链式反应（PCR）、逆转录PCR（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR（rRT-PCR）检测11种常见蜜蜂病原体；对6个蜂场（每个暴露风险区各2个）进行16S rRNA基因V3–V4高变区扩增子测序，使用DADA2流程处理数据，基于SILVA数据库进行物种注释，并进行α多样性、β多样性、差异丰度分析（ANCOM-BC）和微生物关联网络分析。

三、研究结果

蜂场管理和蜂群健康评估

问卷调查显示，除L-VI-10蜂场位于山区外，其余蜂场均位于平原地区。13个蜂场周围为农业用地，以一年生作物和永久性作物为主。14个蜂场使用草酸进行冬季瓦螨防治，仅H-VI-5蜂场在采样前5天使用阿米特拉兹塑料条处理。所有蜂场均未观察到异常行为或感染临床症状。

PFAS残留检测

红色区所有7个蜂场均至少检出一种目标分析物，短链PFASs占主导地位，所有蜂场均检出PFBA。H-VI-1蜂场检出9种PFASs，PFBA和PFPeA浓度最高（分别为1.924 μg kg^?1和1.025 μg kg^?1），PFOA最大浓度为3.03 μg kg^?1。黄色区仅I-PD-3检出PFNA和PFBA，I-PD-2仅检出PFNA。棕色区仅L-PD-4检出PFOS（0.087 μg kg^?1）。GenX和C₆O₄在所有蜂场均未检出。

农药残留检测

农药残留在高风险区7个蜂场中的5个被检出，包括杀菌剂氰霜唑和苯酰菌胺、杀螨剂阿米特拉兹以及被禁用的有机磷杀虫剂毒虫畏（在H-VI-7浓度最高，达0.0244 μg/bee）。黄色区4个蜂场均未检出农药残留。棕色区仅L-VR-1检出霜霉威和肟菌酯。

蜜蜂病原体检测

所有15个蜂场均未检出C. mellificae、V. apis、KBV和IAPV。L. passim在4个蜂场检出，V. ceranae在6个蜂场检出（三个风险区各2个）。DWV和SBV在所有15个蜂场中均被检出，BQCV除2个蜂场外在其余蜂场均检出，CBPV在6个蜂场检出，ABPV在3个蜂场检出。病原体分布与PFAS暴露区域无显著相关性。

蜜蜂肠道细菌群落

共获得11,595,085条原始读段，经质量过滤后得到2604个ASV。鉴定出25个核心微生物属，整体微生物群落主要由乳杆菌属（Lactobacillus）、巴尔通体属（Bartonella）、Bombilactobacillus属、斯诺德格拉斯氏菌属（Snodgrassella）、吉利亚梅拉菌属（Gilliamella）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）组成，约占全部微生物组成的80%。α多样性分析显示，丰富度指数从棕色区到黄色区和红色区呈递增趋势，棕色区与红色区之间、黄色区与红色区之间存在显著差异。β多样性分析显示棕色区与红色区之间的微生物群落组成存在显著差异（pseudo-F_2,15 = 2.39，R² = 0.242，p = 0.001）。ANCOM-BC分析发现，Lelliottia（LFC = 2.82，调整后p = 0.030）和Klebsiella（LFC = 5.63，调整后p = 0.0014）在红色区的相对丰度显著高于棕色区。

微生物关联网络结构

红色区网络具有最高的边密度（0.620）、正关联比例（63.18%）和自然连通性（0.266），以军团菌属（Legionella）、Silvania属、链霉菌属（Streptomyces）、漫游球菌属（Vagococcus）和Pluralibacter属为中心。黄色区网络表现出最高的聚类系数和模块度（0.750和0.161），结构更模块化。棕色区网络密度较低（0.566），以Solirubrobacter属和Paraclostridium属为中心。

PFAS–特征共现模式

定性共现分析显示PFAS与农药、病原体之间无显著关联。PFNA与Microbacterium属在3个蜂场中共现，Jaccard指数为1.00。定量相关分析显示，PFPeA、PFBS和PFOA与Citrobacter、Escherichia、Microvirga、Paenibacillus等属存在最强正相关（ρ = 1.00），PFOS与Lactobacillus属呈最强正相关（ρ = 0.65），PFPeA、PFBS和PFOA与Frischella、Gluconacetobacter和Potamosiphon属呈最强负相关（ρ = ?0.85）。但所有关联在FDR校正后均不显著。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究结果进一步支持蜜蜂作为有效环境生物指示物的作用，并揭示了PFAS污染梯度效应：高风险区蜂场表现出最高的PFAS生物蓄积水平。短链PFASs的主导地位与其高环境迁移性和水溶性一致，蜜蜂体内某些PFAS浓度高于地表水中的浓度，表明蜜蜂可提供实时环境污染物压力指标。农药残留与PFAS共现可能产生混合物毒性效应，但检测到的农药浓度远低于急性毒性阈值。病原体分布与PFAS暴露区域无显著相关性。

关于肠道微生物群，核心微生物群在三个区域中保持相对稳定，但β多样性分析显示高风险区与低风险区之间存在显著组成差异。Klebsiella和Lelliottia的富集可能反映受人为污染栖息地的暴露而非PFAS直接作用。网络分析显示不同区域的微生物群落组织方式存在差异，但受限于每个区域仅2个生物学重复，结果应视为探索性。PFAS与特定细菌属的关联多为低流行率特征驱动的表观关联，不能建立因果关系。

研究结论为：蜜蜂可作为监测环境PFAS污染的高敏感性生物指示物，其PFAS浓度和化学特征随蜂场地理位置而变化，为环境健康地图和大规模监测策略提供支持。研究结果提供了PFASs对蜜蜂肠道群落影响的初步信息，但农药和病原体的共存导致缺乏明确证据。需要进一步研究阐明PFAS相关毒性效应的机制，蜜蜂作为环境哨兵生物是评估生态系统化学压力的有前景方法，可支持识别不同污染压力区域，为未来生态风险评估和保护策略做出贡献。