鼻内递送Netrin-1 modRNA细胞外囊泡减轻缺血性卒中后神经元凋亡

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Intranasal Netrin-1 modRNA-Loaded Extracellular Vesicles Reduce Neuronal Apoptosis after Ischemic Stroke

专业术语翻译： 缺血性卒中仍然是全球范围内导致死亡和长期神经功能障碍的主要原因之一，而有效的神经保护疗法仍然有限。Netrin-1是一种具有神经保护作用的多功能导向分子，化学修饰mRNA（modRNA）为瞬时治疗性蛋白表达提供了一个有前景的平台。然而，将modRNA安全高效地递送至缺血脑组织仍然是临床转化的主要障碍。在本研究中，研究人员构建了来源于人脐带间充质干细胞（hUMSCs）的负载Netrin-1 modRNA的细胞外囊泡（EV@mNetrin-1），并通过非侵入性鼻内途径给药。EV介导的递送使Netrin-1 modRNA在神经元内翻译为蛋白，并增加了缺血脑组织中的Netrin-1表达。在体外实验中，EV@mNetrin-1在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）后显著减少神经元凋亡并提高神经元存活率。在体内实验中，鼻内给予EV@mNetrin-1增强了脑内Netrin-1表达，减少了梗死体积，改善了神经功能结局，并减轻了短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）小鼠的神经元凋亡。在机制上，EV@mNetrin-1的神经保护作用与DCC依赖性PI3K/AKT信号通路的激活相关。综上所述，这些发现证明了鼻内EV介导的Netrin-1 modRNA递送对缺血性卒中的治疗潜力，并支持RNA疗法在中枢神经系统疾病中的开发。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

缺血性卒中（ischemic stroke）约占所有卒中病例的80%，是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一，给医疗系统带来了沉重的社会经济负担。尽管静脉溶栓和机械取栓等再灌注疗法显著改善了临床结局，但其临床应用仍受限于狭窄的治疗时间窗和严格的适应证标准。此外，再灌注本身可能通过继发性损伤级联反应加重神经元损伤，进一步影响神经功能恢复。神经元凋亡（neuronal apoptosis）是缺血性脑损伤的主要贡献因素之一。然而，尽管经过数十年的研究，大多数神经保护策略未能实现临床转化，主要原因在于血脑屏障（BBB）递送效率低下以及缺血脑组织中靶点结合不足。因此，开发高效且临床可应用的神经保护剂递送策略仍是缺血性卒中治疗中的重大挑战。

Netrin-1是一种分泌型层粘连蛋白相关分子，具有多种生物学功能，已在实验性卒中模型中显示出神经保护作用，包括调节炎症、维持BBB完整性以及抑制神经元凋亡。这些保护作用通过受体依赖性信号传导介导。Netrin-1与多种受体相互作用，包括结直肠癌缺失基因（DCC）、neogenin以及UNC5受体家族成员。Netrin-1/DCC信号传导激活下游促生存通路并抑制缺血诱导的神经元凋亡。既往研究表明，脑内给予重组Netrin-1蛋白或病毒载体介导的Netrin-1过表达可改善实验性缺血性卒中模型的神经功能。然而，Netrin-1的治疗应用受限于缺乏能够在缺血脑内实现持续蛋白表达的高效递送策略。

为解决传统蛋白疗法的局限性，化学修饰mRNA（modRNA）已成为一种多功能平台，可实现快速起效和低免疫原性的瞬时蛋白表达，为治疗性蛋白的原位生产提供了有前景的策略。然而，裸modRNA易被快速降解且细胞摄取效率低，因此需要开发有效的递送系统。目前多种递送平台正在深入研究，包括脂质纳米颗粒（LNPs）和细胞外囊泡（EVs）。尽管LNPs已革新了mRNA疫苗开发，但其在中枢神经系统疾病中的应用仍受限于潜在的免疫原性和毒性、肝脏优先蓄积以及组织特异性递送欠佳等问题。相比之下，EVs，特别是来源于人脐带间充质干细胞（hUMSCs）的EVs，因其良好的生物相容性、低免疫原性、递送生物活性货物的能力以及固有的治疗潜力，已成为有前景的天然核酸载体。此外，EVs可被工程化改造以装载外源性核酸如modRNA，同时保留源自亲代细胞的固有治疗特性，从而提供双重治疗益处。

然而，实现核酸治疗药物向脑内的高效非侵入性递送仍是一大挑战。鼻内给药已成为中枢神经系统药物递送的一种有吸引力的策略，因为它能使治疗药物通过嗅觉和三叉神经通路绕过BBB。既往研究已证明，鼻内给予的hUMSC来源EVs可被tMCAO小鼠缺血脑区的神经细胞内化。基于上述背景，本研究旨在建立一种鼻内EV介导的modRNA递送平台，通过将化学修饰的Netrin-1 mRNA装载入hUMSC来源EVs（EV@mNetrin-1），探究这种非侵入性EV-based modRNA递送策略能否增强缺血脑内Netrin-1表达、减轻神经元凋亡、减少梗死体积并改善神经功能，同时探索DCC信号通路在介导EV@mNetrin-1神经保护作用中的参与。

二、主要技术方法

研究人员采用超速离心法从hUMSCs条件培养基中分离纯化EVs，并通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和Western blotting进行表征鉴定。利用体外转录合成Netrin-1、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和荧光素酶的modRNA，并通过Exo-Fect试剂将modRNA装载入EVs，使用RiboGreen RNA检测试剂盒评估包封效率。采用PKH26和DiR荧光染料分别标记EVs用于细胞摄取和生物分布研究。动物实验使用雄性C57BL/6J小鼠建立tMCAO模型，于缺血后3小时经鼻内给予EV@mNetrin-1（1.0×101?颗粒/只），通过活体及离体荧光成像评估脑内分布，采用mNSS和EBST评估神经功能，甲酚紫染色评估梗死体积。体外实验使用原代皮层神经元建立OGD/R模型，通过TUNEL染色、CCK-8实验评估细胞凋亡和活力，采用siRNA敲低DCC表达，并通过Western blotting和qPCR检测相关蛋白和基因表达。

三、研究结果

1. 1.
   EV介导的modRNA递送可实现高效的神经元表达

研究人员通过Exo-Fect试剂将Netrin-1 modRNA装载入hUMSC来源EVs，TEM证实EVs和EV@mNetrin-1具有典型的杯状形态，NTA显示粒径分别为124.4 nm和140.1 nm，Western blotting确认了典型EV标志物（CD63、TSG101、CD81、CD9）的表达且calnexin阴性。Netrin-1 modRNA的包封效率为52.1%，RT-qPCR证实EV@mNetrin-1中Netrin-1 mRNA水平较EVs高约6×10?倍。PKH26标记的EVs可在6小时内被MAP2阳性原代神经元有效摄取。以EV@mEGFP作为报告系统，原代神经元在12小时检测到EGFP荧光，48小时达到峰值，随后逐渐下降但持续至144小时，表明EV介导的modRNA递送能够在神经元中实现稳健且持续的蛋白表达。

1. 2.
   EV@mNetrin-1增强神经元Netrin-1表达并减轻OGD/R后凋亡

在正常培养条件下，Western blotting显示EV@mNetrin-1组的Netrin-1蛋白表达显著高于其他各组，且CCK-8实验未观察到明显细胞毒性。在OGD/R条件下，TUNEL染色显示EV、EV@mLuc和EV@mNetrin-1组的神经元凋亡均较PBS组减少，其中EV@mNetrin-1组的凋亡进一步显著降低；CCK-8实验显示EV@mNetrin-1组的神经元活力较EV和EV@mLuc组进一步增强，而PBS组与裸mNetrin-1组之间无显著差异。

1. 3.
   鼻内给药可实现EV向缺血脑组织的递送及神经细胞摄取

DiR标记EVs经鼻内给药后，活体成像显示脑区荧光信号随时间增加，3小时即显著升高，12小时达峰，24小时仍维持较高水平。离体成像显示24小时时EV-DiR组脑内荧光信号显著高于sham组，且缺血半球荧光更强；心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏经多重比较校正后无显著差异。PKH26标记EVs经鼻内给药后，免疫荧光染色显示其在缺血区与神经元（NeuN阳性）、小胶质细胞（Iba1阳性）和星形胶质细胞（GFAP阳性）共定位，其中神经元中PKH26荧光更为常见，提示神经元是摄取鼻内递送EVs的主要细胞群体。

1. 4.
   鼻内给予EV@mNetrin-1增强缺血脑内Netrin-1表达

tMCAO小鼠经鼻内给予PBS、EV或EV@mNetrin-1后3天，Western blotting显示EV@mNetrin-1组的Netrin-1蛋白表达显著高于PBS和EV组，qPCR结果一致显示EV@mNetrin-1组的Netrin-1 mRNA水平显著升高。免疫荧光染色显示Netrin-1荧光与NeuN阳性神经元共定位，且EV@mNetrin-1组在缺血半球和对侧半球的Netrin-1?/NeuN?细胞比例均显著高于其他各组，证实鼻内递送的EV@mNetrin-1可在体内实现Netrin-1的有效表达，且主要定位于神经元。

1. 5.
   EV@mNetrin-1减轻tMCAO小鼠缺血性脑损伤并改善神经功能

甲酚紫染色显示EV和EV@mNetrin-1组的梗死体积均较PBS组显著减小，且EV@mNetrin-1组的梗死体积较EV组进一步减小。mNSS评分和EBST结果显示EV@mNetrin-1组的神经功能显著优于PBS和EV组。TUNEL/NeuN共染色显示EV和EV@mNetrin-1组的TUNEL阳性神经元数量均较PBS组显著减少，且EV@mNetrin-1组较EV组进一步减少。

1. 6.
   EV@mNetrin-1促进缺血脑内PI3K/AKT信号传导并减轻神经元凋亡

Western blotting分析显示，EV@mNetrin-1组的p-PI3K/PI3K比值和p-AKT/AKT比值均显著高于PBS和EV组，BCL2/BAX比值显著升高，cleaved caspase-3表达显著降低，而EV单独处理未显著改变这些凋亡相关蛋白。

1. 7.
   DCC参与EV@mNetrin-1诱导的PI3K/AKT激活和神经元凋亡减轻

siRNA敲低实验证实DCC mRNA表达降至对照的约29.36%，蛋白表达降至约40%。在OGD/R条件下，EV@mNetrin-1组的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著升高，BCL2/BAX比值增加，cleaved caspase-3表达降低；DCC敲低后，EV@mNetrin-1诱导的这些信号改变和抗凋亡效应均被部分逆转，表明DCC是介导EV@mNetrin-1神经保护作用的关键受体。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，mRNA疗法具有瞬时高效蛋白表达、无基因组整合风险等优势，而EVs相比合成脂质载体在mRNA递送中表现出更好的细胞摄取和组织穿透能力。本研究采用Exo-Fect外源性装载策略，相比电穿孔等方法能更好地保留EV膜完整性和生物学活性。鼻内给药可通过嗅觉和三叉神经通路绕过BBB实现脑内递送，EVs在缺血半球更强的蓄积可能与缺血诱导的BBB通透性改变和局部微环境变化有关。EV@mNetrin-1在EV固有治疗作用基础上进一步增强了神经保护效果，其机制至少部分依赖于DCC介导的PI3K/AKT信号通路激活。研究也指出了局限性，包括小鼠模型的转化相关性需进一步验证、主要关注短期疗效、机制研究主要集中于DCC介导的信号通路等。

研究结论：研究人员构建了携带Netrin-1 modRNA的EVs，并证明了其在鼻内给药后对缺血性卒中的神经保护作用。EV@mNetrin-1增强了缺血脑内Netrin-1表达，减少了神经元凋亡和梗死体积，改善了神经功能，其保护作用至少部分通过DCC依赖性信号传导介导。这些发现支持鼻内递送EV@mNetrin-1作为缺血性卒中后神经保护的一种有前景的治疗策略。