低氧驱动的HIF1α–EZH2表观遗传轴在肠外营养相关性胆汁淤积症巨噬细胞极化中的作用及FXR介导的保护机制

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Role of HIF1α in FXR-mediated protection and anti-inflammatory macrophage polarization in parenteral nutrition-associated cholestasis

肠外营养相关性胆汁淤积症（parenteral nutrition-associated cholestasis，PNAC）是需要长期肠外营养（parenteral nutrition，PN）的婴幼儿和儿童中的一种重要并发症，以肝脏炎症、胆汁淤积为特征，并可能进展为纤维化和肝衰竭。巨噬细胞介导的肝脏炎症是PNAC发病机制的核心，部分由肠道吸收的细菌产物如脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）以及肠外营养脂质乳剂成分（包括植物固醇）所引发。研究人员假设组织低氧和低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α）的激活在PNAC期间调节巨噬细胞极化、肝脏炎症和肝损伤中发挥重要作用。本研究证明，PNAC诱导肝巨噬细胞中的组织低氧驱动的HIF1α激活；髓系特异性Hif1a敲除可减轻炎症并恢复法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）信号通路；HIF1α与zeste homolog 2增强子（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）相互作用以抑制抗炎基因程序；FXR激动剂破坏EZH2磷酸化；EZH2抑制可减轻肝损伤和炎症反应。研究人员还发现FXR介导的抗凋亡长链非编码RNA H19上调，该RNA与HIF1α相互作用，在PNAC低氧应激下促进肝细胞存活。这些发现为PNAC期间巨噬细胞中低氧信号、表观遗传调控和核受体通路之间的串扰提供了机制性见解，并强调了靶向FXR信号和表观遗传调节因子以减轻该疾病炎症和肝损伤的治疗潜力。

论文解读

一、研究背景与科学问题

肠外营养相关性胆汁淤积症（parenteral nutrition-associated cholestasis，PNAC）是长期依赖肠外营养（parenteral nutrition，PN）的婴幼儿和儿童面临的重大临床挑战，其病理特征包括肝脏炎症、胆汁淤积，并可能进展为肝纤维化和肝功能衰竭。尽管营养配方和支持性治疗不断改进，针对PNAC潜在发病机制的有效治疗手段仍然匮乏，该疾病依然是制约依赖肠外营养患儿救治的重要障碍。巨噬细胞介导的肝脏炎症是PNAC发病的核心环节，其激活部分源于肠道细菌产物（如脂多糖，lipopolysaccharides，LPS）的吸收以及肠外营养脂质乳剂中植物固醇（phytosterols）等成分的作用。在其他疾病模型中，肠道炎症可导致局部组织低氧——由炎症细胞浸润的氧消耗和微血管功能障碍引起——进而稳定低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α）并激活促炎下游通路。LPS也可诱导巨噬细胞中HIF1α的激活，这一现象已被证明可促进胆汁淤积小鼠的肝纤维化。尽管HIF1α对细胞低氧反应至关重要，但持续的HIF1α激活可维持巨噬细胞的促炎极化，从而促进慢性肝病中的肝损伤。

表观遗传调控在控制巨噬细胞表型和功能中发挥关键作用。zeste homolog 2增强子（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是多梳抑制复合物2（Polycomb Repressive Complex 2，PRC2）的催化亚基，介导组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），从而促进巨噬细胞中的基因沉默。EZH2也被证明可与HIF1α相互作用以调节基因激活，因此是PNAC期间肝巨噬细胞中可能参与HIF1α信号和基因调控的潜在候选表观遗传修饰因子。法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）是一种胆汁酸激活的核受体，调节胆汁酸代谢并在肝脏发挥抗炎作用。FXR激动剂已在多种胆汁淤积性肝病中显示出肝保护特性，包括PNAC小鼠和仔猪模型。近期证据表明，FXR信号可通过影响翻译后修饰和染色质相互作用来调节包括EZH2在内的表观遗传调节因子。

基于上述背景，研究人员提出假设：HIF1α激活和组织低氧在PNAC期间调节巨噬细胞极化、肝脏炎症和肝损伤中发挥重要作用，而FXR激活可能通过干扰低氧驱动的HIF1α–EZH2表观遗传调控来发挥保护作用。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用成年雄性C57BL/6小鼠建立PNAC模型：小鼠先经口给予葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）4天以诱导肠道通透性增加，随后通过颈静脉中心静脉导管接受14天肠外营养输注（DSS-PN小鼠）。实验分组包括：Chow对照组、DSS-PN组、DSS-PN联合FXR激动剂GW4064处理组（30 mg/kg/天，第4至14天）、髓系特异性Hif1a敲除小鼠（Hif1a^loxP/loxP LysMCre+）接受DSS-PN处理组，以及DSS-PN联合EZH2抑制剂Tazemetostat处理组（10 mg/kg/天，第4至14天）。此外，研究人员还纳入了来自科罗拉多儿童医院的人源肝组织样本（PNAC患儿与非胆汁淤积性年龄匹配疾病对照组，每组4例）进行验证。

关键技术方法包括：腹腔注射哌莫硝唑（pimonidazole，PMDZ）结合免疫荧光共聚焦显微镜检测组织低氧；免疫印迹检测蛋白表达；定量RT-PCR检测基因表达；批量RNA测序（RNA-seq）结合基因集富集分析（GSEA）解析转录网络；染色质免疫沉淀（ChIP）检测转录因子与启动子区域的结合；免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白相互作用；RNA免疫沉淀（RIP）检测RNA-蛋白相互作用；流式细胞术和胱天蛋白酶3/7发光法检测细胞凋亡；以及体外细胞实验（RAW264.7巨噬细胞、THP-1单核细胞、骨髓来源巨噬细胞BMDMs）结合siRNA敲低、低氧培养（1% O?）和药物处理进行机制验证。

三、研究结果

2.1 PNAC中的低氧证据和低氧诱导因子-1α：研究人员通过PMDZ染色发现DSS-PN小鼠肝脏中低氧信号显著增加，且与巨噬细胞标志物F4/80共定位增强，表明肝巨噬细胞存在低氧。定量RT-PCR显示DSS-PN小鼠肝内单核细胞（IHMCs）中Hif1a及其靶基因（Slc2a1、Vegfa、Eno1）和Ezh2表达升高，肝匀浆中HIF1α蛋白水平增加。RNA-seq和GSEA分析证实低氧相关基因集在DSS-PN肝脏中显著富集，27个低氧调控基因中大多数在DSS-PN组中上调。人PNAC肝组织中HIF1A及其靶基因（SLC2A1、VEGFA、EZH2）和促炎CCL2表达同样升高。LPS腹腔注射可诱导肝脏和BMDMs中PMDZ信号增加及Hif1α、Ezh2、Slc2a1、Tlr4表达上调。髓系特异性Hif1a敲除小鼠（Hif1a^loxP/loxP LysMCre+）在DSS-PN处理后血清ALT和AST显著降低，门管区炎症和巨噬细胞浸润减轻。结论：PNAC期间肝巨噬细胞存在组织低氧和HIF1α信号增强，髓系HIF1α缺失可预防生化和组织学肝损伤。

2.2 髓系特异性HIF-1α缺失促进PNAC期间STAT6激活和抗炎巨噬细胞极化：Hif1a^loxP/loxP LysMCre+/DSS-PN小鼠肝脏中STAT6调控的抗炎基因（Arg1、Chil3、Clec10a1、Il13ra1、Mrc1、Sox9、Abca1、Pparg）表达显著升高。siRNA敲低HIF1α的RAW264.7细胞和THP-1单核细胞中STAT6及其下游靶基因表达上调，免疫荧光和免疫印迹证实磷酸化STAT6水平增加。ChIP实验显示Hif1a敲除小鼠肝脏中STAT6在Arg1启动子区域的结合增加。结论：髓系HIF1α缺失促进STAT6激活和抗炎巨噬细胞极化，与PNAC期间的肝脏保护相关。

2.3 HIF1α缺失增强PNAC期间的肝脏FXR信号：Hif1a^loxP/loxP LysMCre+/DSS-PN小鼠中FXR靶基因（Abcb11/BSEP、Abcc2/MRP2、Abcg8、Nr0b2/SHP、Nr5a2/LRH1、Ppara）表达恢复，ChIP显示FXR在Abcb11和Nr0b2启动子的结合在DSS-PN小鼠中减少但在Hif1a敲除小鼠中恢复。GW4064处理DSS-PN小鼠同样增加STAT6靶基因表达和STAT6在Arg1启动子的结合。在THP-1细胞中，HIF1α敲低或GW4064处理均降低LPS和植物固醇诱导的IL1B、IL6、TNF表达。GW4064在低氧条件下抑制RAW264.7细胞中HIF1α靶基因（Eno1、Slc2a1、Vegfa、Nos2）的表达，并减少PNAC小鼠肝脏中的PMDZ低氧信号。结论：髓系HIF1α缺失恢复肝脏FXR信号，FXR激活与HIF1α抑制在促进抗炎巨噬细胞极化方面具有协同效应。

2.4 FXR激动剂调节EZH2磷酸化并破坏PNAC期间巨噬细胞中的HIF1α–EZH2复合物：免疫共沉淀显示DSS-PN小鼠肝脏中HIF1α与EZH2存在物理相互作用，GW4064处理可阻止该相互作用。低氧培养的RAW264.7细胞中HIF1α与T367磷酸化EZH2共定位，GW4064处理后显著减少。免疫印迹显示DSS-PN小鼠肝脏中EZH2 T367位点（激活位点）磷酸化增加，GW4064处理后降低；而T311位点（抑制位点）磷酸化在DSS-PN中减少，GW4064处理后增加。GW4064处理还增加AKT和AMPK的磷酸化并减少p38激酶的磷酸化。LPS和植物固醇处理的RAW264.7细胞中HIF1α与pT367-EZH2共定位增加，GW4064逆转此效应。结论：FXR激活通过调节AKT、AMPK和p38激酶介导的EZH2磷酸化状态，破坏低氧诱导的HIF1α–EZH2复合物形成。

2.5 FXR–EZH2串扰调节PNAC中的巨噬细胞极化和凋亡：GW4064处理的DSS-PN小鼠IHMCs中抗炎基因（Arg1、Maf、Klf4）表达升高，促炎基因（Tnfsf1、Ezh2、Cd80、Ccl5、Cxcr3、Neat1、Cd68）表达降低。RAW264.7细胞中GW4064抑制LPS和植物固醇诱导的促炎基因（Cd80、Tnf、Slc2a1）并诱导Arg1表达。ChIP-qPCR显示DSS-PN小鼠肝脏中Arg1启动子处EZH2结合和H3K27me3富集增加、H3K4me3减少，而Neat1启动子呈现相反模式；GW4064处理和HIF1α缺失均逆转这些表观遗传改变。低氧条件下RAW264.7细胞Arg1启动子处EZH2和H3K27me3富集增加，GW4064逆转此效应。此外，GW4064处理减少DSS-PN小鼠肝细胞凋亡（PI染色和胱天蛋白酶3/7活性降低），上调抗凋亡长链非编码RNA H19表达，并增强HIF1α与H19的物理相互作用。结论：FXR激活和HIF1α缺失通过EZH2介导的表观遗传重塑促进巨噬细胞从促炎向抗炎表型转换，并通过H19-HIF1α相互作用减少肝细胞凋亡。

2.6 EZH2抑制减轻PNAC中的肝脏炎症并恢复胆汁转运体表达：Tazemetostat处理的DSS-PN小鼠血清AST和ALT显著降低至接近Chow对照组水平，F4/80?巨噬细胞浸润减少。Tazemetostat恢复DSS-PN小鼠中受抑制的胆汁和固醇转运体基因（Abcg8、Abcb11、Abcc2）表达，但不影响Cyp7a1。Tazemetostat降低IHMCs中促炎基因（Cd68、Ccl2、Cd80）并增加抗炎基因（Clec10a1、Klf4）表达。在BMDMs和RAW264.7细胞中，Tazemetostat抑制LPS和植物固醇诱导的促炎基因（Hif1a、Il1b、Nos2、Cd80、Tnf、Slc2a1）表达并诱导抗炎转录因子Klf2。低氧条件下Tazemetostat抑制Eno1和Vegfa表达及pT367-EZH2蛋白水平。结论：EZH2药理学抑制可减轻PNAC相关肝损伤、恢复胆汁转运体表达并促进抗炎巨噬细胞极化。

四、讨论与结论

本研究首次在PNAC小鼠肝脏中提供了肝巨噬细胞组织低氧的免疫组化证据，并证明髓系特异性HIF1α基因抑制可促进STAT6信号和肝脏FXR激活，从而驱动肝巨噬细胞从促炎向抗炎表型转换并保护肝脏免受PNAC损伤。关键发现是鉴定出HIF1α–EZH2复合物是PNAC期间巨噬细胞促炎基因表达的低氧诱导调节因子。PNAC期间的组织低氧促进HIF1α与EZH2的物理相互作用，增加EZH2在抗炎基因启动子处的结合和H3K27me3沉积，从而表观遗传沉默抗炎基因程序。FXR激活通过调节AKT、AMPK和p38激酶介导的EZH2磷酸化状态（增加T311抑制位点磷酸化、减少T367激活位点磷酸化）来破坏HIF1α–EZH2复合物，减少H3K27me3富集并恢复抗炎基因的染色质可及性。此外，FXR激活上调抗凋亡lncRNA H19并增强其与HIF1α的相互作用，促进低氧应激下肝细胞存活。研究人员同时指出，PNAC是一种涉及肝细胞、胆管细胞、内皮细胞和免疫细胞的多细胞疾病，本研究聚焦于巨噬细胞在PNAC中的作用，未进行肝细胞或胆管细胞特异性Hif1a功能缺失或过表达实验，因此不能确定髓系HIF1α单独足以驱动完整的PNAC表型，未来需要细胞类型特异性研究来明确巨噬细胞与实质细胞HIF1α信号的相对贡献。

结论：本研究构建了一个框架，即PNAC期间组织低氧和HIF1α信号通过EZH2相互作用促进巨噬细胞介导的炎症和肝细胞损伤，而FXR激动剂通过激活激酶破坏促炎性HIF1α–EZH2相互作用并促进抗炎巨噬细胞极化来对抗这些效应。这些发现提示靶向FXR信号和表观遗传调节因子具有缓解PNAC及其他胆汁淤积性肝病肝脏炎症和损伤的治疗潜力。