假单胞菌（Pseudomonas）增强土壤磷生物有效性并促进玉米幼苗生长及影响土壤微生物群落

《Applied and Environmental Microbiology》：Pseudomonas enhances soil phosphorus bioavailability and maize seedling growth and affects soil microbial community

　　

土壤中磷的低生物有效性是作物生产的重要限制因子，接种磷酸盐增溶细菌（phosphate-solubilizing bacteria, PSB）已被认为是有效方法。本研究获得两株具有高溶磷能力的菌株，即 Pseudomonas veronii 1416X3 和 Pseudomonas sp. 1616X1，并将其用于盆栽试验，以考察菌株对土壤磷含量、玉米植株生长和土壤微生物群落的影响。结果表明，接种PSB后4天，1416X3组有效磷（available phosphorus, AP）含量（8.11 mg/L）和1616X1组（6.77 mg/L）显著高于对照组（4.97 mg/L），分别增加1.63倍和1.36倍。接种PSB后，土壤根际（rhizosphere）微生物群落发生变化。1416X3组微生物群落变化表现为 Arthrobacter 和 Nocardioides 相对丰度增加；而1616X1组中，该菌株通过有效定殖和溶磷改变微生物群落。为进一步阐明 Pseudomonas 溶磷机制，研究人员对 P. veronii 1416X3 和 Pseudomonas sp. 1616X1 进行全基因组测序（whole-genome sequencing）。结果揭示若干与溶磷代谢和磷转运系统（pstSCAB-phoU）相关的基因，以及有机酸产生相关基因（gcd、pqqB-F、mqo 和 ttuC）。因此，本研究为将 Pseudomonas 菌株用作微生物磷肥奠定基础，为可持续农业提供有效且生态友好的替代方案。

研究背景：磷是植物生长必需营养元素，但土壤总磷虽丰富，超过95%的磷为不可溶形态，易被固定，植物难以直接利用，导致磷肥利用率普遍偏低。长期大量施用磷肥不仅造成资源浪费，还增加土壤磷向环境扩散和污染的风险。全球磷肥消费量在2019年达到5135万吨，并以约2%的年增长率增加。农业土壤有效磷（available phosphorus, AP）不足已成为限制全球农业可持续发展的关键因素。磷酸盐增溶细菌（phosphate-solubilizing bacteria, PSB）能够溶解难溶性无机磷酸盐，在土壤磷循环和提高植物磷有效性中发挥重要作用，且接种PSB可重塑作物根际微生物群落和代谢谱，进而促进作物生长。假单胞菌（Pseudomonas）环境适应性强，是广泛应用的一类PSB，但其溶磷的精确分子机制仍不清晰。基于此，研究人员从中国江苏太湖沉积物中分离获得两株具有溶磷能力的 Pseudomonas 菌株，并开展玉米促生、土壤磷含量和根际微生物群落研究，同时进行全基因组测序，以解析其溶磷和促生机制。研究结果可为开发基于本土功能菌株的微生物磷肥提供菌种资源和理论依据，为缓解土壤“总磷储量高但有效磷供应低”的问题、减少化学磷肥依赖和推进绿色农业发展提供技术路径。

关键技术方法概述（不超过250字）：研究人员以中国太湖（31°27′N，120°01′E）沉积物为样本来源，经Pikovskaya和NBRIP培养基筛选PSB，结合16S rRNA基因测序、系统发育分析和全基因组系统发育及平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）鉴定菌株；优化pH、温度、碳源和氮源等溶磷条件；构建玉米盆栽试验，测定土壤AP、pH、有机酸及植株生长和总磷；采用16S rRNA基因V₃–V₄区扩增子测序分析根际细菌群落，并利用全基因组测序、组装、COG/GO/KEGG/CAZymes注释和比较基因组分析解析溶磷相关基因。

研究结果：
PSB的分离与鉴定（Isolation and identification of PSB）：从太湖沉积物中分离到11株PSB，其溶磷能力范围为88.53–963.47 mg/L，未接种对照为21.62 mg/L。菌株1416X3溶磷能力最高，释放963.47 mg/L AP，培养基pH降至3.8；1616X1次之，AP为684.37 mg/L，最终pH为4.2。两株均为革兰阴性杆状菌。16S rRNA基因序列分析显示，1416X3与 Pseudomonas fildesensis KG01 同源性最高（99.65%），1616X1与 Pseudomonas putida ICMP 2758 同源性最高（99.37%）。基于全基因组系统发育和ANI计算，1416X3与 Pseudomonas veronii 的ANI为98.32%，超过95%物种界定阈值，鉴定为 Pseudomonas veronii 1416X3；1616X1的ANI为85.68%，鉴定为 Pseudomonas sp. 1616X1。显色平板和定量试验表明，两株主要通过酸化微环境溶解难溶磷酸盐，对磷酸钙、磷酸氢钙和植酸钙产生溶磷圈，且对磷酸钙和磷酸氢钙的溶磷能力显著高于其他磷源，因此后续选用磷酸钙进行试验。

PSB溶磷效率优化（Optimization of PSB’s phosphorus-solubilizing efficiency）：在碳源中，葡萄糖最有效增强两株菌溶磷能力，1416X3溶磷量接近800 mg/L。在氮源中，硫酸铵最有利于溶磷，1416X3最高超过800 mg/L，1616X1最高为576.38 mg/L。初始pH 6.0–7.5对1416X3溶磷能力无显著影响，pH 7.0时溶磷量为774.52 mg/L；1616X1在pH 6.0时溶磷能力最高，为619.03 mg/L。温度升高会降低两株菌溶磷能力，1416X3在28°C时溶磷量最高，为750 mg/L；1616X1在25°C时最高，为627.89 mg/L。综合最适参数：1416X3为pH 7.0、28°C、葡萄糖、硫酸铵；1616X1为pH 6.0、24°C、葡萄糖、硫酸铵。

PSB对土壤AP含量的影响（Effects of PSB on soil AP content）：盆栽试验中，1416X3组和1616X1组土壤AP含量高于对照组，各组AP在0–4天逐渐升高后下降。1416X3组接种后第4天AP达到最大值8.11 mg P/kg，pH为7.85；1616X1组第4天AP最大值为7.67 mg P/kg，pH为7.34，说明两株菌在复杂土壤环境中仍保持溶磷能力。有机酸测定显示，1416X3总有机酸从10025.66 mg/L增至17815.71 mg/L，葡萄糖酸、柠檬酸、丙酮酸和α-酮戊二酸增加，最大溶磷时检测到乙酸和乳酸；1616X1总有机酸从10833.71 mg/L增至18002.69 mg/L，葡萄糖酸、乙酸和柠檬酸增加。两株均以产生葡萄糖酸为主，并伴随柠檬酸和乙酸增加。基于初始pH和有机酸产量的理论计算显示，接种PSB理论上可将土壤pH降至约3，但实测土壤pH仅在7.3–8.5范围内小幅波动，说明土壤缓冲体系主导pH变化，Pseudomonas 可能主要通过根际局部酸性环境而非改变整体土壤pH来溶磷，分泌的有机酸可能具有更特异的螯合功能。

PSB对植物生长的影响（Effects of PSB on plant growth）：接种后25天内，PSB接种组玉米株高高于对照组。接种后第12天，1416X3组株高达到对照组的2.1倍。根长测定显示，1416X3组在接种后16天内根长较长；从接种后第12天起，1616X1组根长显著增加，第20天超过1416X3组。与对照组相比，1416X3组和1616X1组玉米鲜重和干重均增加，且随着植株生长，总磷含量增加；接种后第16天后，1416X3组和1616X1组总磷含量显著增加。

根际微生物群落分析（Rhizosphere microbial community analysis）：接种PSB后第8天分析原始未种植土壤、对照组、1616X1组和1416X3组根际微生物群落。与对照组相比，PSB接种处理降低土壤微生物群落物种丰富度和多样性，可能源于接种PSB成功定殖后对土著微生物的竞争排斥。门水平上，Actinobacteriota、Proteobacteria、Chloroflexi和Acidobacteriota为主要细菌类群；1416X3组中Actinobacteriota相对丰度增加而Proteobacteria降低，1616X1组中Proteobacteria增加而Actinobacteriota降低。属水平上，1416X3组 Arthrobacter 相对丰度增加、Nocardioides 降低；1616X1组 Pseudomonas 和 Nocardioides 增加、Massilia 降低。主坐标分析显示不同处理根际细菌群落显著聚类，表明接种PSB显著重塑根际微生物群落。LEfSe分析显示，1416X3组显著富集 Actinobacteria、Actinobacteriota，1616X1组显著富集 Proteobacteria、Pseudomonadales，且 Pseudomonas 在1616X1组显著定殖富集。Spearman相关分析显示，1416X3组植物干重、株高和鲜重与 Arthrobacter 和 Knoellia 正相关，土壤AP和根长与 unclassified_f__Microbacteriaceae 正相关，土壤pH与 Rubellimicrobium、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales、Gaiella 和 norank_f__Gemmatimonadaceae 正相关，与 Nocardioides 和 Cellulomonas 负相关；1616X1组AP、株高和总磷与 Pseudomonas 显著正相关，Streptomyces 和 MND1 与植物干重正相关，土壤pH与 Arthrobacter 正相关。总体上，P. veronii 1416X3作为生态调节者，通过重塑微生物组和富集有益类群间接促进植物生长；Pseudomonas sp. 1616X1作为直接功能执行者，通过有效定殖和溶磷发挥作用。

全基因组测序分析（Whole-genome sequencing analysis）：P. veronii 1416X3基因组大小为6,789,479 bp，GC含量60.82%，含6,208个编码基因；Pseudomonas sp. 1616X1基因组大小为5,957,620 bp，GC含量61.55%，含5,535个编码基因。1416X3的COG、GO和KEGG注释显示氨基酸转运与代谢基因数量最高，代谢途径基因丰富；CAZymes注释发现大量植物促生相关编码家族基因，并具有完整磷酸ABC转运系统（PstA、PstB、PstC、PstS和PhoU），还发现与吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）产生、固氮和铁载体产生相关基因。其柠檬酸循环相关基因可产生柠檬酸、草酰乙酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸和α-酮戊二酸，编码丙酮酸脱氢酶E1、E2（aceE、aceF）、异柠檬酸脱氢酶（IDH3）和乙酰辅酶A水解酶/转移酶（aarC）；丙酮酸代谢相关基因涉及乳酸、乙酸、草酰乙酸、丙酮酸、富马酸和苹果酸，并观察到乙醛脱氢酶（mhpF）、醛脱氢酶（aldB）和苹果酸脱氢酶（maeB）。Pseudomonas sp. 1616X1的COG注释显示磷酸特异性转运系统相关基因 pstS、pstA、pstB 和 phoU；KEGG注释显示其有机酸生物合成遗传基础强大，包括428个碳水化合物代谢基因、28个TCA循环基因、56个丙酮酸代谢基因和38个磷酸戊糖途径基因，并存在低亲和力无机磷酸转运体（pit）基因；GO注释发现有机酸合成相关基因（gcd、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF、mqo和ttuC）及磷饥饿响应调控基因（phoB和phoR）；CAZymes注释中糖基转移酶丰度最高。比较基因组分析显示，两株共享3253个核心基因家族，1416X3和1616X1分别具有2807和2232个独特基因家族；核心溶磷基因，包括磷酸特异性转运系统（pstSCAB-phoU）、磷饥饿响应调控（phoB/R）和有机酸合成酶（gcd、pqqB-F、mqo和ttuC）在拷贝数上保守。膦酸和次膦酸代谢途径中，phnX拷贝数比为2:2，phnW为1:1，而1416X3独有 pat、phnZ 和 pbfD 基因。两株差异涉及 mhpF 和 aldB，可能导致有机酸代谢途径差异，从而造成溶磷表型细微差异。

讨论部分总结：土壤磷生物有效性是限制作物生长和农业绿色可持续发展的重要因素。本研究从太湖沉积物中分离的两株溶磷 Pseudomonas 菌株，其溶磷能力显著超过已报道参考菌株 Enterobacter cloacae NG-33（180.7 mg/L）。盆栽试验证实接种 P. veronii 1416X3 或 Pseudomonas sp. 1616X1 可提高玉米株高、鲜重和干重。低分子量有机酸分泌是PSB提高土壤AP的主要途径，并与植物促生密切相关。两株菌通过两种生态位策略实现促生：1416X3强烈富集与植物生长相关的有益细菌，通过调控微生物群结构间接促进生长；1616X1显著定殖，其丰度与土壤AP和植物总磷直接相关，在直接溶磷和供磷中发挥核心作用。两种策略体现功能互补的生态位分化，共同构成根际促生的多层级调控系统。Pseudomonas 因具有改善土壤养分、产生IAA等植物激素和抑制土传病原菌等多重生物肥料活性，被认为是高效PSB和重要生物接种剂。基因组分析显示，两株菌含多个编码溶磷功能的基因，包括参与葡萄糖向葡萄糖酸周质氧化相关的L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶、磷酸特异性转运操纵子 pstA、pstB、pstC、pstS 及 PhoB、PhoH、PhoR 等磷调控因子。Pseudomonas 溶磷主要依赖有机酸产生，通过柠檬酸循环和丙酮酸循环溶解难溶性磷。核心溶磷基因在菌株间保守，支持其共同高效溶磷能力；差异基因如 mhpF 和 aldB 可能导致有机酸代谢途径分化。整体而言，强大代谢网络是两株菌高效溶磷的核心驱动：活跃基础代谢合成多种有机酸，通过质子外排降低微环境pH直接溶磷；降解复杂有机物的能力为这一耗能过程提供碳源和能量，使其在贫营养环境中也能发挥作用。

结论翻译：总之，本研究采用生理表型、植物生长响应和基因组分析相结合的综合方法，系统阐明 P. veronii 1416X3 和 Pseudomonas sp. 1616X1 的高效溶磷和植物促生机制。菌株 P. veronii 1416X3 通过重塑根际微生物组并富集有益细菌间接促进植物生长，而 Pseudomonas sp. 1616X1 通过高效根部定殖和溶磷发挥直接作用。研究人员的发现表明，Pseudomonas 可采用分化的生态策略增强植物磷营养。值得注意的是，观察到的促生作用可能归因于溶磷与其他潜在植物促生机制（如植物激素产生和铁载体分泌）的组合，未来需要引入磷酸盐梯度对照的研究以进一步量化溶磷的具体贡献。总体而言，这些发现为其开发为绿色农业微生物制剂奠定了坚实的理论和菌株特异性基础。