《Microbiology Spectrum》：Optimizing diagnosis of Mycobacterium tuberculosis latent infection: ELISpot as a technique of choice for samples with high negative control values in QuantiFERON assay
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世界卫生组织认为全球约四分之一人口受潜伏结核感染（LTBI）影响，并建议LTBI患者接受抗结核治疗，以避免进展为活动性结核及后续传播。此外，接受免疫抑制治疗（如抗TNF-α抗体）的患者构成了日益增长的高危人群，强烈建议在治疗开始前进行LTBI筛查。改善LTBI
世界卫生组织认为全球约四分之一人口受潜伏结核感染（LTBI）影响，并建议LTBI患者接受抗结核治疗，以避免进展为活动性结核及后续传播。此外，接受免疫抑制治疗（如抗TNF-α抗体）的患者构成了日益增长的高危人群，强烈建议在治疗开始前进行LTBI筛查。改善LTBI诊断和患者管理依赖于广泛部署的实验室检测的准确性，如γ-干扰素释放试验（IGRAs）。QuantiFERON-TB检测是全球应用最广泛的IGRA之一。在某些情况下，当阴性对照（Nil）超过8 IU/mL时，结果可能被判定为不确定，从而延迟或阻碍适当的患者护理。在2022年11月至2025年11月期间，格勒诺布尔大学医院检测的6,600例患者中有57例（0.8%）出现此情况。其中34例患者后续使用QuantiFERON-TB和/或基于ELISpot的T-SPOT.TB检测进行了重新评估。在15例再次使用QuantiFERON-TB检测的样本中，12例最终结果为阳性，3例仍为不确定。相比之下，所有19例使用T-SPOT.TB检测的患者均获得明确的阳性结果。研究人员建议，当QuantiFERON-TB结果因Nil值升高而判定为不确定时，重复IGRA检测至关重要，T-SPOT.TB检测是首选解决方案。研究结果突出了一种加强LTBI诊断的有效策略，能够实现及时化学预防、防止进展为活动性疾病，并为全球结核病控制作出贡献。
论文解读
一、研究背景与意义
潜伏结核感染（LTBI）被定义为在无临床证据表明结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mt）感染的情况下，机体对Mt抗原产生免疫反应的状态，受影响个体具有进展为活动性结核及后续传播的风险。据估计，全球约四分之一人口受LTBI影响，因此准确诊断是结核病控制策略的基石。在高收入国家，LTBI筛查被推荐用于来自结核病流行国家的移民或确定的接触病例等高风险人群，同时也是免疫抑制治疗或器官移植前基线评估的组成部分。随着全球免疫抑制剂使用的增加，尤其是接受抗TNF-α治疗的自身免疫性疾病患者，LTBI筛查的重要性日益凸显。
γ-干扰素释放试验（IGRAs）是唯一可用于诊断LTBI的生物学检测方法，通过检测T淋巴细胞在Mt复合物特异性肽段刺激后产生的干扰素-γ（IFN-γ）来判定结果。与结核菌素皮肤试验不同，IGRAs使用的肽段在大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）疫苗亚株中不存在，从而降低了既往接种相关假阳性结果的风险。目前主要有两种IGRA技术：QuantiFERON-TB Gold Plus（QIAGEN）和基于ELISpot的T-SPOT.TB检测（Oxford Immunotec Ltd.）。QuantiFERON-TB Gold Plus因其可自动化操作、无需细胞分离或细胞培养专业知识而被更广泛采用。
尽管QuantiFERON-TB Gold Plus检测具有可靠性，但不确定结果（ITRs）仍可能发生，阻碍诊断，尤其是LTBI诊断。ITRs对临床决策构成挑战，特别是在评估预防性治疗必要性时。最常见且研究最充分的ITRs原因是阳性对照条件中与丝裂原接触的细胞刺激失败。而本研究关注的是一种较少见但临床相关的原因——阴性对照管（Nil管）中IFN-γ浓度超过8 IU/mL。虽然已有研究提出改良实验室方案来克服高Nil值不确定结果，但这些方法劳动强度大且不易在常规临床实践中应用。相比之下，本研究评估了一种基于重复IGRA检测的务实策略，据研究人员所知，这是调查该策略的最大队列研究，为Mt感染诊断中与Nil浓度升高相关的QuantiFERON-TB Plus不确定结果的管理提供了真实世界证据。
二、研究设计与技术方法
本研究为单中心回顾性研究，在格勒诺布尔阿尔卑斯大学医院免疫学系开展。研究分析了2022年11月至2025年12月期间共6,600例QuantiFERON-TB Gold Plus检测结果，仅纳入满足所有必要分析前质量标准和符合推荐孵育时间的样本。收集的数据包括患者人口统计学信息（年龄、性别、国籍）以及QuantiFERON-TB Gold Plus检测和T-SPOT.TB ELISpot检测的生物学结果（如有）。
研究使用的主要技术方法包括两种IGRA检测体系：QuantiFERON-TB Gold Plus检测采用全血直接采集至四个不同的采血管中（Nil阴性对照管、含植物血凝素PHA的丝裂原阳性对照管、两个TB抗原管TB1和TB2），孵育16至20小时后使用夹心化学发光免疫分析定量释放的IFN-γ。T-SPOT.TB ELISpot检测则需从全血中通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs），在四种条件下孵育后，通过酶联免疫斑点法检测分泌IFN-γ的活化淋巴细胞，每个斑点对应一个产生IFN-γ的细胞。
三、研究结果
总体QuantiFERON-TB检测结果分布。 在6,600例受试者中，5,618例（85%）为阴性结果，588例（9%）为阳性结果，396例（6%）为不确定结果。在不确定结果中，339例（86%）在阳性对照（丝裂原）管中无反应，57例（14%）在Nil管中IFN-γ水平升高（>8 IU/mL），后者占全部检测样本的0.8%。
高Nil值不确定结果患者的重复检测。 在57例Nil管IFN-γ水平升高的患者中，23例失访，34例进行了新的血液采样（距首次采样的中位时间为30天）。34例重复检测者中，15例为女性、19例为男性，平均年龄43.4岁，28例（82%）出生于结核病流行国家。15例仅重复QuantiFERON-TB检测的患者中，12例结果为阳性（Nil值仍升高但低于阈值，平均Nil值为3.21 IU/mL），3例仍为不确定结果且无法进一步采样进行T-SPOT.TB检测，这3例均来自高风险流行地区，其中1例确诊为活动性淋巴结结核，另外2例由法国结核病控制诊所转介且高度怀疑结核感染。11例仅使用T-SPOT.TB检测的患者全部获得阳性结果。8例同时使用两种检测的患者中，4例两种检测均为阳性且结果一致，另外4例QuantiFERON-TB Gold Plus仍为不确定结果，而ELISpot检测返回阳性结果，使诊断得以明确。
统计学分析。 McNemar配对检验显示，初始结果与重复检测结果之间在两种方法中均存在显著差异（两种方法P < 0.001）。由于T-SPOT.TB未观察到阴性结果导致数据准完全分离，混合效应逻辑回归模型无法估计，因此采用非参数Fisher精确检验，结果表明两种方法之间存在统计学显著差异（P = 0.011）。
四、讨论与结论
讨论总结。 QuantiFERON-TB是应用最广泛的IGRA检测方法，其优势在于成本较低、实验室流程简化且对细胞培养专业知识要求较低。最新一代QuantiFERON-TB Gold Plus（QFT-Plus）相比早期版本具有更高的敏感性、更低的ITRs和更好的可重复性。然而，ITRs仍可能发生，最常见原因是阳性对照中PHA刺激后IFN-γ分泌不足，常见于淋巴细胞减少或免疫抑制患者。本研究关注的高Nil值ITRs在文献中较少描述，其机制可能包括样本中异嗜性抗体的存在、结核病患者自发性IFN-γ分泌增加等。值得注意的是，本研究中82%的高Nil值重复检测者出生于结核病流行国家，且所有3例反复出现ITRs的患者均确诊或高度怀疑结核感染，提示活化炎症状态可能促成升高的背景IFN-γ水平。已有研究提出改良检测方案（如以细胞培养基替代血浆）可降低不确定结果率，但劳动强度大。重复采样和IGRA检测是解决高Nil值ITRs的推荐策略。本研究结果表明，当QuantiFERON-TB结果因高Nil值而不确定时，重复采样至关重要，因为重复检测常可获得阳性结果。在可获得的情况下，基于ELISpot的T-SPOT.TB检测应优先于QuantiFERON-TB检测，因为PBMC分离过程可消除循环IFN-γ和异嗜性抗体，从而最小化背景干扰。此外，T-SPOT.TB不受免疫抑制治疗或淋巴细胞减少的影响。
研究结论。 在改进诊断方法问世之前，临床医生应认识到，当QuantiFERON-TB结果因高Nil值而不确定时，重复采样至关重要，因为重复检测常可获得阳性结果。在可获得的情况下，基于ELISpot的T-SPOT.TB检测可能是一种有价值的替代方案，在本研究队列中，所有重新采样的患者均获得了可解释的结果并支持LTBI诊断。研究结果还为法国国家卫生管理局（HAS）的建议提供了额外证据支持，即在免疫功能低下患者中，阴性或不确定的IGRA结果可能需要进行重复IGRA检测，因为阳性结果可能促使化学预防以防止进展为结核病。总体而言，研究结果提出了一种加强LTBI诊断的有效策略，能够实现及时化学预防、防止进展为活动性疾病，并为结核病控制作出贡献。
