癌症治疗中PROTACs评估的筛选试验全景：基于2020—2025年95项研究的六阶段分类、方法学缺口与标准化需求

《Drug Discovery Today》：Overview of screening assays used to evaluate PROTACs for cancer treatment

本综述文章描述了从2020年至2025年发表的95篇文章中归纳的、用于评估蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）生物活性的最常用筛选试验。研究人员识别出基于评估PROTACs相应作用机制所处阶段而划分的六个主要筛选试验类别。约98%的参考文献使用Western blotting（WB）评估PROTACs中的降解，使该筛选试验成为实验室中最广泛使用的技术。研究人员识别出大多数文章未采用泛素化试验（仅7篇文章测量其目标蛋白（protein of interest, POI）的泛素化）。大多数文章使用显著不同的筛选试验组合来评估PROTACs的疗效并确认作用机制，这表明在研究尚无明确标准方案以对PROTACs活性进行有意义的比较。最后，研究人员强调每种筛选方法的原理、主要优点和缺点。

研究背景与问题：靶向蛋白降解已成为扩展药理可及蛋白范围的有效策略。PROTACs（proteolysis-targeting chimeras，蛋白水解靶向嵌合体）是异双功能分子，由结合靶蛋白的配体、招募E3连接酶的部分和连接子组成，通过促进靶蛋白与E3连接酶形成三元复合物，诱导泛素化及随后的蛋白酶体降解。与经典占位驱动药理学不同，PROTACs通过事件驱动机制发挥作用，其催化循环可在相对低浓度下产生持续效应。为降解目标蛋白（protein of interest, POI），PROTACs必须形成有效三元复合物；但三元复合物形成依赖浓度，过高浓度会降低有效三元复合物形成并减少靶蛋白降解，即hook效应。因此，在命中筛选和先导优化中定量试验选择尤其重要。首个PROTAC于2001年开发，2015年后设计进展推动其作为抗癌治疗药物发展。Vepdegestrant（ARV-471）为2026年首个FDA批准的PROTAC。该综述聚焦临床前抗癌PROTAC，继Liu et al. 2020后，检索2020—2026年研究，纳入95篇，旨在概述筛选试验、方法学缺口及其对理解PROTAC机制的贡献，并纳入抗癌活性试验。研究人员开展描述性文献综述，得出多数研究缺少清晰标准方案，泛素化直接评估有限，需整合机制驱动流程。

关键技术方法：该研究为描述性文献综述，使用Web of Science平台，检索词为(cancer* or anti-proliferative or anticancer*) and (PROTAC or PROTACs or proteolysis-targeting chimera)，纳入95篇文章。研究人员按PROTAC作用关键阶段分类：结合与靶标结合、三元复合物形成、泛素化机制、靶蛋白降解以及体外和体内抗癌活性，并统计各筛选试验使用频率，总结其原理、优缺点和代表性应用。

结合试验（Binding assays）：95篇中29篇使用结合试验，最常用荧光偏振（fluorescence polarization, FP）获取K_d值；也使用细胞热位移试验（cellular thermal shift assay, CETSA）、药物亲和响应靶稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）和差异扫描荧光（differential scanning fluorimetry, DSF）。高二元亲和力不能单独预测降解。FP用于MDM2和SOS1靶向PROTACs，ZZ151二元SOS1亲和力略降但增强三元复合物形成，显示正协同（α=11.4；K_d,binary=93.0 nM；K_d,ternary=8.13 nM），并经表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）验证。SPR无标记、实时，提供K_d及k_on、k_off；CP5V靶向Cdc20的K_d约11–12 μM。时间分辨荧光共振能量转移（time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET）用于PXR靶向PROTACs，37和38亲和力最高，但38亲和力高于37而降解效率相似，说明亲和力并非唯一决定因素。等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry, ITC）仅3篇，NC1对PLK1 PBD的K_d=6.06 μM仍可诱导PLK1降解。CETSA用于4篇评估靶标结合。其他结合试验包括AlphaScreen、竞争抑制、DARTS+CETSA、AlphaLISA和DSF。

三元复合物形成试验（Ternary complex formation assays）：95篇中仅8篇实验评估三元复合物。协同性α=K_d,binary/K_d,ternary，正协同（α>1）与更好降解效力相关。TR-FRET最常用，其次FP和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP），AlphaLISA、SPR和邻近连接试验（proximity ligation assay, PLA）较少。TR-FRET用于PXR–VCB和SOS1–9d–VCB，可评估hook效应。AlphaLISA用于BCL-xL/CRBN并显示对BCL-2选择性。SPR可测K_d,ternary、k_off和t_1/2=ln2/k_off，用于SOS1 9d。FP用于SPMI–HIF2-1。Co-IP用FLAG标签POI验证NR4A1–PROTAC–VHL。PLA验证NR4A1与VHL邻近。其他包括NanoBRET仅2篇，DT2216诱导BCL-XL与VHL三元复合物；X射线晶体学解析VHL–MZ1–BRD4。

泛素化机制试验（Ubiquitination mechanism assays）：95篇中65篇评估泛素–蛋白酶体系统（ubiquitin–proteasome system, UPS）参与，采用五策略：蛋白酶体抑制、Co-IP、NEDD8活化酶（NEDD8-activating enzyme, NAE）抑制、E3连接酶敲低和CRBN或VHL配体竞争。Co-IP+WB为唯一直接评估POI泛素化的方法，但半定量。蛋白酶体抑制剂中MG-132最常用，其次bortezomib、epoxomicin、carfilzomib和ixazomib，浓度0.5–10 μM，处理24–48 h；MZ1研究使用MG-132浓度梯度，Zheng等用MG-132和carfilzomib评估cyclin D1–CDK4/6降解。Co-IP仅9篇，CP134在10 μM增加DYRK2泛素化。NAE抑制剂MLN4924（pevonedistat）阻断cullin neddylation和cullin–RING E3连接酶（CRLs），常与MG-132合用；Li等用MG-132或MLN4924阻断MD-224诱导的MDM2降解。CRBN/VHL配体竞争用10–20 μM游离配体，Wang等用pomalidomide竞争U3i与CRBN，降低EZH2降解。E3连接酶敲低仅3篇，Xu等验证DP-15依赖CRBN。其他泛素化试剂盒未在95篇中使用。

靶蛋白降解试验（Target protein degradation assays）：95篇中94篇评估降解，93篇用WB，最广泛；2篇用毛细管WB（Simple Western），8篇免疫荧光，5篇质谱蛋白质组学，5篇HiBiT，3篇ELISA，1篇双荧光流式。HiBiT为11氨基酸标签，与LgBiT重组NanoLuc，发光信号与POI量成比例，可敏感、快速、定量监测活细胞降解，但需CRISPR/Cas9插入，标签可能影响蛋白。

体外和体内抗癌活性评价（Evaluation of in vitro and in vivo anticancer activity）：93/95篇评估体外抗癌活性，53篇报告体内模型。细胞活力与增殖试验（Cell viability and proliferation assays）：CCK-8最常用，其次MTT、Cell Titer-Glo、MTS、SRB；以IC₅₀比较，处理24–96 h。细胞凋亡试验（Cellular apoptosis assays）：42篇用Annexin V–FITC/PI流式，5篇评估caspase；Mannion等显示RIPK1靶向PROTAC诱导凋亡和caspase-3活化。集落形成试验（Colony formation assay）：27篇使用，7–14天，结晶紫染色；Huang等用HDAC8降解剂处理SK-N-BE(2)-C 96 h后无处理6天，集落数和面积减少。体内试验（In vivo assays）：55篇，细胞系来源异种移植（cell line-derived xenograft, CDX）最常见，2篇患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX），1篇斑马鱼+CDX。药效动力学研究（Pharmacodynamic studies）：免疫组化（immunohistochemistry, IHC）和WB评估肿瘤靶蛋白降解；给药途径以腹腔注射最多，其次瘤内、静脉、口服；口服仅4篇，ARV-825用骆驼奶来源外泌体递送；仅3篇实验测溶解度。药代动力学研究（Pharmacokinetic studies）：21篇评估PK，腹腔注射最多，均用液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）；ARV-471和ARV-110验证；Luo等整合SIAIS562055的PK/PD。

结论与展望（Conclusions and perspectives）：PROTACs为肿瘤学新兴治疗模式，其催化机制对常规药物筛选和跨无细胞、细胞和体内模型整合提出挑战。该综述总结2020—2026年抗癌PROTACs生物学试验并识别方法学缺口。几乎所有研究评估蛋白降解，主要用WB，但泛素化试验相对有限。多数研究组合多种互补方法，但试验选择和报告差异大，缺乏直接筛选路径，需要整合方法支持开发与转化。未来进展依赖标准化、机制驱动工作流程，系统评估从靶标结合、三元复合物形成到泛素化、蛋白酶体降解、PKs和最终抗癌疗效。标准化将提高可比性并减少转化阻力。直接到生物学（direct-to-biology, D2B）平台可通过新合成分子直接进入生物试验而无需大量中间纯化，加速高通量筛选、构效关系研究和候选PROTACs发现。

研究局限（Limitations of the study）：仅使用Web of Science平台及指定关键词，可能遗漏一些文章，如新兴PROTAC筛选技术或非肿瘤领域PROTAC；仅纳入95篇以提供清晰概览并深入分析。

研究结论部分翻译：PROTACs是一种新兴治疗模式，在肿瘤学中具有巨大潜力，但其独特催化机制给常规药物筛选方法以及跨无细胞、基于细胞和体内模型的结果整合带来挑战。本综述总结了2020年至2026年间用于评估抗癌PROTACs的生物学试验，并识别出重要方法学缺口。尽管几乎所有研究均评估了蛋白降解，且主要采用WB，但泛素化试验（降解前关键机制步骤）相对有限。多数研究结合了多种互补方法以表征PROTACs效力和机制；然而，试验选择与报告仍存在显著差异，凸显缺乏直接筛选路径，以及需要整合方法以支持PROTACs候选药物的开发与转化。未来进展将在很大程度上依赖标准化、机制驱动的工作流程，系统评估PROTACs生命周期各阶段：从初始靶标结合和三元复合物形成，到泛素化、蛋白酶体降解、PKs和最终抗癌疗效。标准化这些流程将提高研究间可比性并减少转化阻力。展望未来，直接到生物学（D2B）平台为加速高通量筛选提供了有吸引力的途径。通过使新合成分子无需大量中间纯化即可直接进入生物试验，D2B方法可实现快速并行合成与评价。该方法可扩展化学探索、加速构效关系研究，并更高效地支持有前景PROTACs候选药物的识别。