积雪-叶面界面异养细菌草图基因组及其碳水化合物降解潜力分析

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genomes of seven bacterial isolates from the snow-phyllosphere interface

　　

摘要

积雪与植物叶面之间的界面是一种短暂的环境，为微生物生命提供了独特的机会。本文介绍了从美国康涅狄格州米德尔敦一处草坪叶面接触的积雪中分离的七个菌株的草图基因组，这些菌株分属于红球菌属（Rhodococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、胶质菌属（Mucilaginibacter）、草生杆菌属（Herbiconiux）和小杆菌属（Microbacterium）等属。

公告

植物叶面栖息着能够降解多种碳水化合物（1）的微生物。积雪覆盖为叶面微生物带来了多种适应性挑战，包括因植物光合速率降低而导致的潜在营养胁迫（2）。为了研究在积雪覆盖条件下栖息于叶面的微生物可能具备的适应性特征，我们在威斯里安大学（美国康涅狄格州米德尔敦，北纬41.5529635°，西经72.6560295°）一处以草本植物为主的混种草坪上采集了已积聚的积雪，旨在分离出适应于寡营养环境中生长的异养细菌。一场重要冬季风暴后的第十二天，我们从部分融化的雪堆边缘无 aseptically 采集了50毫升积雪，此处积雪与草坪表面直接接触。积雪在室温下融化45分钟后，用无菌滤器处理的去离子水分别稀释至最终浓度10%和1%。将每个稀释度（100 μL）分别接种于Reasoner's 2A琼脂（R2A，BD Difco）平板上，在室温下培养一周后，选择形态学上不同的菌落进行分离。所有菌株均在R2A琼脂上重新划线接种，于28°C培养48小时后置于4°C保存。菌株经革兰氏染色后，在1,000倍光学显微镜下观察。根据细胞大小以及观察到芽殖和假菌丝体而排除了真菌菌株，最终留下七个细菌菌株用于进一步测序。

提取基因组DNA时，挑取单个菌落接种于5毫升营养肉汤（BD Difco）中，在28°C、225 RPM摇动条件下过夜培养。通过离心收集细胞，将细胞沉淀重悬于400 μL DNA/RNA Shield（Zymo）中。使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit（Zymo）按照制造商的标准方案从重悬的沉淀中提取DNA。使用Qubit dsDNA Broad Range assay（Invitrogen）测定DNA浓度。

全基因组测序和文库构建由SeqCenter（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）完成。DNA文库使用Illumina DNA Prep Kit构建，采用自定义双索引，在Illumina NovaSeq X Plus测序仪上进行测序，产生双端151 bp reads。使用bcl-convert v4.2.4进行去混洗、质控和接头去除，reads导入KBase平台（3–5）使用所有步骤的默认参数进行组装和分析。使用Trimmomatic v0.39对reads进行修剪（6），剩余的双端reads使用SPAdes v3.15.3进行组装（7）。使用CheckM v1.0.18评估基因组完整性和污染水平（8），使用GTDB-Tk v2.3.2进行分类学分配（9）。使用DRAM v0.1.2对组装结果进行注释（10），并使用HMMER v3.3.2对dbCAN2中的碳水化合物活性酶进行搜索（11），鉴定了推测的糖苷水解酶（GH）、多糖裂解酶（PL）和辅助活性（AA）基因（12）。

草图基因组的大小范围为3,725,448至5,690,849 bp，GC含量在40.1%至70.1%之间（表1）。菌株基因组中包含13至49个GH基因家族、0至5个PL基因家族和3至6个AA基因家族（表1）。七个菌株中有五个在种水平上未能分类（表1）。这些结果表明，积雪-叶面界面可能富含具有显著碳水化合物降解潜力的新型可培养物种。

表1

表1 组装与注释统计信息

菌株	320_LB	320_CC	320_RR	320_HR	320_ES	320_PA	320_CQ
分类学归属	Herbiconiux sp.	Sphingomonas sp.	Sphingomonas sp.	Mucilaginibacter sp.	Rhodococcus sp.	Microbacterium testaceum	Pseudomonas lutea
基因组大小（bp）	3,725,448	4,338,477	4,338,832	4,560,564	4,873,107	4,123,647	5,690,849
重叠群数	10	10	12	8	12	15	50
N50（bp）	737,172	955,900	955,900	1,117,169	831,121	517,988	207,470
GC含量（%）	70.771	65.081	65.078	44.079	66.219	70.072	60.101
读取量	10,370,136	9,933,396	7,863,834	13,346,078	9,642,622	8,247,294	8,074,560
蛋白编码基因	3,412	3,972	3,971	4,093	4,522	3,266	4,991
覆盖度	384.5×	292.1×	258.9×	376.5×	261.5×	282.9×	203.8×
完整性（CheckM，%）	99.2	99.2	99.2	98.1	97.7	99.5	99.7
污染率（CheckM，%）	1.01	1.16	1.16	0.71	1.32	0.0	0.54
最近参考序列（GTDB-Tk）	Herbiconiux solani（GCF_001571005.1）	无最近参考序列报告	无最近参考序列报告	Mucilaginibacter terrenus（GCF_003432065.1）	Rhodococcus trifolii（GCF_014635345.1）	Microbacterium testaceum_A（GCF_900104345.1）	Pseudomonas_E lutea（GCA_000759445.1）
最近参考序列ANI（GTDB-Tk，%）	89.98	无最近参考序列 报告	无最近参考序列报告	93.58	85.34	98.72	98.04
PL家族数	0	5	5	1	0	1	2
GH家族数	25	43	43	49	15	26	13
AA家族数	3	6	6	5	6	4	6
BioSample编号	SAMN59720156	SAMN59345545	SAMN59349852	SAMN59349849	SAMN59349851	SAMN59349850	SAMN59349848
读取量登录号	SRR39431792	SRR39431793	SRR39431794	SRR39431797	SRR39431795	SRR39431796	SRR39431798
组装登录号	JCAWAD000000000	JCAWAE000000000	JCAWAF000000000	JCAWAI000000000	JCAWAG000000000	JCAWAH000000000	JCAWAJ000000000

致谢

本工作由MICRONet资助，该基金属于NSF RCN-UBE项目（编号：#2418285）。