香豆素衍生的过氧亚硝酸根荧光探针：从环境水监测到活细胞氧化应激评估

《Environmental Research》：Chromene-Derived Peroxynitrite Fluorescent Probes: From Environmental Water Monitoring to Oxidative Stress Assessment in Living Cells

　　

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  设计并合成了一种基于二苯并吡喃衍生物的荧光探针（LK）。
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  探针LK对ONOO^-表现出优异的选择性和抗干扰性能。
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  利用LK开发了基于智能手机的ONOO^-可视化检测平台。
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  探针LK对HeLa细胞表现出低细胞毒性和良好的膜通透性。

引言

过氧亚硝酸盐（ONOO^-）由一氧化氮（NO）与超氧阴离子（O₂•^-）通过扩散限制的偶联反应生成，是一种具有显著生物活性的强氧化剂和硝化剂（Fraszczak et al., 2010; Guo et al., 2014; Ieda et al., 2012）。该物质参与多种生理信号级联反应，在正常条件下有助于免疫防御（Ferrer-Sueta and Radi, 2009; Perillo et al., 2020）。然而，其异常生成与氧化应激、炎症反应、神经退行性疾病以及肿瘤的发生和发展密切相关（Casas et al., 2020; Holmstr?m and Finkel, 2014; Moldogazieva et al., 2018）。在水相体系中，ONOO^-也可通过等离子体活化水生成等过程产生（Gan et al., 2025a; Tarabová et al., 2019; Zhou et al., 2018; Thirumdas et al., 2018; Z. Wang et al., 2024）。其短暂的生命周期（约10-20 ms）和极高的化学反应活性严重阻碍了在复杂生物基质中进行实时、原位和特异性检测（Kong et al., 2024; Li et al., 2024; Liu et al., 2024; Zhang et al., 2024）。传统的检测技术，如电子顺磁共振（ESR）（Gan et al., 2025b）和紫外-可见分光光度法（Wang et al., 2025），由于操作复杂、反应时间长以及对精密仪器的依赖，往往不适合现场监测。因此，迫切需要开发适用于环境水体和生物样本分析的高选择性ONOO^-探针。

荧光探针由于其高灵敏度、良好的时空分辨率和使用便捷性，被广泛用于生物活性小分子的监测（Shang et al., 2025; Tan et al., 2024; Wang et al., 2024）。近年来，基于各种响应机制的ONOO^-检测荧光探针得到了广泛开发。这些机制包括：聚集诱导发光（AIE）——通过荧光团在聚集状态下的发射来提高信噪比（Yan et al., 2025; Zhang et al., 2024; Zhong et al., 2024）；基于吸光团与荧光团光谱重叠的内滤效应（IFE）（Li et al., 2024; Zhang et al., 2023）；以及基于分子内电荷转移（ICT）（Li et al., 2024）、荧光共振能量转移（FRET）（Wu et al., 2024）和激发态分子内质子转移（ESIPT）（Chen et al., 2024）的机制；以及多种机制协同作用检测ONOO^-，包括AIE-ESIPT协同（Wang et al., 2023）、ICT-FRET协同（Jing et al., 2022）和AIE-ICT协同（Yang et al., 2024）。尽管取得了这些进展，许多现有探针仍存在响应时间慢、选择性不足或合成路线繁琐等局限性。同时，荧光探针与便携设备——特别是智能手机——的整合，作为促进现场和快速终点分析应用的手段，引起了越来越广泛的关注。

针对上述挑战，如图1所示，本文合理设计了具有D-π-A共轭结构的探针LK，其中萘并吡喃作为给电子基团，氰化苯并噻唑作为受电子单元，通过C=C桥连接。在与ONOO^-反应时，C=C键被选择性氧化断裂，将重构分子内电荷转移过程并引发荧光信号变化。在本工作中，我们首先表征了LK的光物理性能和离子选择性。利用¹H NMR光谱和DFT理论计算进一步探讨了底层的识别机制。随后，我们将探针与基于智能手机的RGB比色分析相结合，构建了便携式传感平台。通过在多种实际水样中进行加标回收实验来评估其在环境监测中的实用性。此外，我们还进行了活细胞共聚焦成像实验，以评估LK追踪生物系统中ONOO^-介导的氧化应激的能力。本研究为环境水体和生物场景中的ONOO^-检测提供了一种潜在的分析工具。

章节摘要

试剂与仪器

材料：2-羟基-1-萘甲醛、丙烯醛、哌啶、苯并噻唑-2-乙腈和1,4-二氧六环购自上海泰坦科技有限公司；碳酸钾购自安徽泽盛科技有限公司；无水乙醇和二甲基亚砜（DMSO）购自广东光华科技有限公司。以上所有试剂均为分析纯。过氧亚硝酸盐（ONOO-）的制备和标定描述见补充材料。

探针LK的设计与制备

探针LK的分子结构中包含氰基苯并噻唑共轭吸电子单元，与萘并吡喃含氧杂环给电子骨架共同形成推-拉电子共轭体系。同时，双键桥刚性化了D-π-A共轭骨架，抑制了分子内旋转，从而减少了非辐射衰减。ONOO^-可选择性断裂LK中的C=C双键桥，使氰基苯并噻唑侧基脱落

基于智能手机的荧光比色法检测ONOO^-

本研究将荧光探针与智能手机技术相结合，基于溶液颜色变化检测ONOO^-，从而创建了便携式、可视化的智能手机传感平台（He et al., 2024; Ou et al., 2020; Yuan et al., 2023）。图4展示了在365 nm紫外光下拍摄的探针溶液智能手机照片，通过色彩识别应用程序提取RGB值。建立了G/B比值与ONOO^-浓度之间的线性校准曲线

结论

本工作报道了一种名为LK的新型荧光探针，用于选择性检测ONOO^-。光谱分析表明，LK对ONOO^-具有高选择性和强抗干扰能力，响应时间小于4分钟，检测限为17.8 nM。该探针与基于智能手机的RGB比色平台的成功整合，证实了其在可视化半定量ONOO^-分析中的实际应用价值。其在环境分析中的可靠性已得到验证

CRediT作者贡献声明

龙青茂：撰写初稿，调查研究，形式分析，数据整理。黄素蕊：形式分析，数据整理。张连鹏：撰写-审阅与编辑，项目管理，方法论，获取研究资金。杨龙：调查研究，形式分析，数据整理。林彦飞：撰写-审阅与编辑，资源提供，概念构思。冯国清：撰写-审阅与编辑，形式分析，数据整理。杜官本：指导监督，获取研究资金

未引用的参考文献

Li et al., 2024; Li et al., 2024; Wang et al., 2024; Zhang et al., 2024.

利益冲突声明：

作者声明不存在利益冲突。

资金支持：

本研究得到国家自然科学基金（22161043）、"兴滇人才计划"青年人才支持项目（YNQR-QNRC-2019-065）、云南省基础研究计划（202301BD070001-239和202605AO120005）以及111计划（D21027）的资助。

利益冲突声明

? 作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（22161043）、"兴滇人才计划"青年人才支持项目（YNQR-QNRC-2019-065）、云南省基础研究计划（202301BD070001-239和202605AO120005）以及111计划（D21027）的资助。

龙青茂|杨龙|林彦飞|黄素蕊|张连鹏|冯国清|杜官本