《PLOS One》：Optimised fluorescence-activated nuclei sorting for epigenomic analysis of cortical cell types
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对基因组功能复杂性的深入理解，使人们日益认识到非序列依赖性调控变异在人类中枢神经系统疾病中的作用。大多数脑组织基因组分析受限于使用包含不同神经细胞类型且具有独特表观遗传谱的异质性混合群体的块状组织，从而限制了将调控变化归因于特定细胞群的能力。鉴于人类死后组织资
对基因组功能复杂性的深入理解，使人们日益认识到非序列依赖性调控变异在人类中枢神经系统疾病中的作用。大多数脑组织基因组分析受限于使用包含不同神经细胞类型且具有独特表观遗传谱的异质性混合群体的块状组织，从而限制了将调控变化归因于特定细胞群的能力。鉴于人类死后组织资源的有限性以及从同一样本整合多组学数据的重要性，迫切需要能够实现平行、细胞类型分辨的基因组分析的方法。研究人员提出了使用荧光激活细胞核分选（fluorescence-activated nuclei sorting，FANS）的优化方案，用于从不同人类和小鼠脑细胞类型中分离细胞核，以进行下游多组学分析。该方法能够从成人和胎儿脑组织中稳健纯化神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞及其他胶质来源的细胞核。研究人员证明，FANS分离的细胞核兼容多种基因组分析，包括DNA修饰、组蛋白修饰、染色质可及性和基因表达分析。该方案最大限度地利用了有限的死后组织资源，并提供了一个统一的流程，用于对脑内分子机制进行全面的、细胞类型特异性的研究。
论文解读
一、研究背景与意义
近年来，全基因组关联研究虽已成功识别出多种神经精神疾病和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、精神分裂症和自闭症）的遗传风险因素，但对于这些变异如何通过功能性机制参与疾病发病过程，目前仍知之甚少。随着对基因组功能复杂性认识的深入，非序列依赖性调控变异在健康和疾病中的作用日益受到重视，其中表观基因组学过程尤为关键——这些过程通过DNA修饰、组蛋白修饰和染色质结构改变在发育层面调控基因表达，在决定人脑细胞类型特异性基因转录模式中发挥核心作用。
然而，目前大多数基于人脑死后组织的转录组和表观基因组分析均采用"块状组织"（bulk tissue），这种组织包含不同神经细胞类型的复杂混合体。由于不同细胞类型具有截然不同的表观遗传特征，块状组织分析无法将调控变化归因于特定细胞群，这严重制约了对影响特定细胞群疾病（如以神经元大量丢失伴胶质细胞活化为特征的阿尔茨海默病）的机制研究。虽然单细胞测序技术已取得重大进展，但受限于成本、规模以及难以从同一样本中分析多种基因组模态的困难。
针对上述挑战，研究人员开发并验证了一套优化的荧光激活细胞核分选（fluorescence-activated nuclei sorting，FANS）方案，可从少量（约300 mg）冷冻保存的人死后皮层组织中同时分离富集神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞的核群，并兼容多种下游基因组分析，包括DNA甲基化、染色质可及性、H3K27乙酰化和基因表达分析。该方案最大限度地利用了有限的死后组织资源，为从同一样本进行全面的、细胞类型特异性的多组学分析提供了统一流程，为研究中枢神经系统疾病的分子通路开辟了新途径。
二、主要技术方法
研究人员采用了多项关键技术方法。首先，通过FANS技术从冷冻人脑皮层组织（约300 mg人出生后皮层、200 mg人胎儿皮层或100 mg小鼠皮层）中分离不同细胞核群，使用针对NeuN（神经元）、SOX10（少突胶质细胞）和IRF8（小胶质细胞）的特异性抗体进行免疫标记，并通过流式细胞术进行分选；小鼠组织则使用PU.1替代IRF8标记小胶质细胞。其次，采用多种下游分析技术：使用Illumina EPIC阵列和Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序分析DNA甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC）；使用ATAC-seq分析染色质可及性；使用CUT&Tag分析H3K27ac组蛋白修饰；使用qPCR、bulk RNA-seq和单核RNA测序（snRNA-seq，分别采用Parse Biosciences和10x Genomics平台）验证细胞类型身份和纯度。人脑组织样本来自多个注册脑库，小鼠样本来自30只成年野生型C57BL/6J小鼠。
三、研究结果
FANS能够分离不同核群用于多组学分析。 研究人员通过FANS从人和小鼠皮层组织中分离出不同的核群，采用分层门控策略确保每个分选群代表总核门内的特定亚群。平均而言，神经元占34.5%±13.5，少突胶质细胞占46.7%±15.9，小胶质细胞占3.3%±1.8，星形胶质细胞占3.2%±3.15。从约300 mg人出生后皮层组织中，该方案可常规获得每个细胞类型50,000个核用于DNA甲基化分析（EPIC阵列）、300,000个核用于核RNA提取、100,000个核用于ATAC-seq、100,000个核用于CUT&Tag分析。
抗体特异性和分选纯度的验证。 通过显微镜成像确认所选抗体特异性标记不同的核群，并通过再分选分析证实NeuN?群具有高纯度和最小污染，证明FANS方案在分离明确核亚群方面的可靠性、特异性和可重复性。
靶向和全基因组基因表达分析确认细胞类型身份。 通过qPCR分析，RBFOX3（神经元标记）在NeuN?核群中高度富集，OLIG2（少突胶质细胞标记）在SOX10?核群中强富集，而NeuN?/SOX10?双阴性群则高表达GFAP（星形胶质细胞标记）和CD68（小胶质细胞标记）。bulk RNA-seq结果进一步确认了qPCR观察到的细胞类型特异性富集模式。
单核RNA测序验证FANS分选核群的转录特征。 通过Parse Biosciences（80,151个核）和10x Genomics Chromium（9,448个核）平台进行的snRNA-seq显示，核主要按FANS富集群而非个体供者聚类，证明批次效应极小、生物学信号强。标记基因表达模式与各FANS分离群的预期身份一致。
DNA甲基化分析确认细胞类型特异性模式。 使用Illumina EPIC v2阵列对来自47个个体（14名女性、33名男性；年龄6-91岁）的四个核群进行全基因组DNA甲基化分析，经质量控制后保留889,069个高质量位点。神经细胞类型去卷积模型确认所有分选群纯度>90%。无监督层次聚类显示样本按核群聚类，神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞和其他胶质细胞之间分离清晰。ONT测序数据进一步揭示了三种核群在5mC和5hmC上的细胞类型差异。
ATAC-seq分析揭示分选核群的染色质景观差异。 研究人员获得了110个NeuN?、119个SOX10?、24个IRF8?和27个三阴性核群的高质量ATAC-seq数据。片段大小分布显示预期的核小体游离和单核小体片段周期性，峰识别确定了每个群体数十万个可及区域，无监督聚类显示不同细胞类型之间的染色质可及性模式存在强分离。
H3K27ac CUT&Tag确认细胞类型特异性增强子景观。 从四个主要FANS分选群获得410个高质量文库，每个群表现出独特的增强子景观，细胞类型内相关性高（0.89-0.96），不同细胞类型间相关性显著较低（0.05-0.43），证明FANS产生的核适用于组蛋白修饰的敏感染色质分析。
整合多组学验证。 在典型标记基因处整合DNA甲基化、ATAC-seq、H3K27ac CUT&Tag和ONT修饰数据，显示一致且高度细胞类型特异性的表观基因组特征，证明FANS产生的核捕获了每种主要脑细胞类型的真实分子身份，可从同一样本进行平行多组学分析。
四、讨论与结论
讨论部分指出，该方案通过方法学改进可靠地分离了人出生后皮层中的神经元（NeuN?）、少突胶质细胞（SOX10?）、小胶质细胞（IRF8?）和星形胶质细胞富集（抗体阴性）核群，以及胎儿和鼠皮层中的对应群体。相比早期仅分离神经元核的方法，该方案扩展了可捕获的细胞类型范围，并实现了从单个约300 mg皮层组织样本中获取四种互补分子数据集（RNA-seq、DNA修饰分析、ATAC-seq和CUT&Tag）的能力。方案还可适应更多细胞类型，如运动神经元（BCL6）、GABA能神经元（SOX6）和星形胶质细胞（LHX2）。然而，该方案存在局限性：死后组织固有地引入组织质量、死后间隔和供者变异性等变量；NeuN作为泛神经元标记并非在所有神经元群中均匀表达，无法区分兴奋性与抑制性神经元或不同投射神经元亚型。
研究结论指出，该方案提供了一种可靠、可扩展且高度适应性的策略，用于从冷冻脑组织中进行细胞类型特异性核分离和多组学分析。通过从同一样本实现多种神经群体的全面分子表征，这些方法最大限度地提高了有限死后资源的利用价值，为研究人脑功能和病理机制开辟了新途径，代表了该领域的重大方法学进展，将支持未来绘制调控架构、模拟疾病机制和识别细胞类型特异性治疗靶点的努力。
