《PLOS Pathogens》：Early-warning surveillance of West Nile and Usutu viruses in wetland and larval habitat waters and in mosquito excreta using digital PCR
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西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）和乌苏图病毒（Usutu virus，USUV）是主要由禽类介导的蚊媒病原体，在温带地区日益引发人类和马属动物疾病。多数感染无症状，法国当前的监测属反应性模式，依赖临床和兽医报告，导致媒介控制和预防干预的信号
西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）和乌苏图病毒（Usutu virus，USUV）是主要由禽类介导的蚊媒病原体，在温带地区日益引发人类和马属动物疾病。多数感染无症状，法国当前的监测属反应性模式，依赖临床和兽医报告，导致媒介控制和预防干预的信号延迟。研究人员于2024年和2025年在法国南部实施了一种前瞻性监测方法，将蚊虫排泄物分子监测（molecular xenomonitoring，MX）与湿地及蚊虫孳生水体中病毒RNA的环境水样检测相结合，通过多重逆转录数字PCR（multiplex reverse transcription digital PCR，RT-dPCR）工作流程实现。分析流程通过空白限、检测限和定量限进行表征。低水平阳性结果经Sanger测序确认。WNV和USUV RNA的重复检出揭示了此前未被识别的隐秘循环，较首例WNV人类病例和马属动物警报提前长达19周。环境监测代表了库蚊（Culex）传播虫媒病毒早期检测的范式转变，是实施前瞻性和有效One Health应对的关键推动因素。
一、研究背景与问题
西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）和乌苏图病毒（Usutu virus，USUV）是温带地区日益严峻的新发威胁。气候变暖、城市化和生物多样性丧失共同改变了蚊虫媒介和鸟类储存宿主的生态、丰度与行为，促进了病毒的地理扩张并增加了暴发频率。这两种禽类嗜神经性正黄病毒（orthoflavivirus）主要由嗜鸟性库蚊（Culex）蚊虫传播，在欧洲以尖音库蚊（Culex pipiens）为主。人类和马属动物属于流行病学上的“死端”宿主，通常病毒血症水平低，无法感染后续叮咬的蚊虫。约80%的WNV感染马或人类无症状，但临床表现可从流感样症状到严重神经侵袭性疾病不等。USUV通常引起轻微或无症状感染，但可引发严重神经系统并发症，尤其在免疫功能低下人群中。目前对这两种病毒均无人类抗病毒治疗药物或疫苗。
自1990年代以来，南欧和东欧反复发生WNV流行，USUV则于2000年代初在欧洲扩散。法国于1962年在卡马格地区发现首例人类和马属动物WNV病例，2016年在蒙彼利埃发现首例人类USUV病例。近年来法国经历了重大的本地获得性人类和马属动物WNV暴发，涉及历史上受影响的地区和新受影响地区，凸显了活跃的病毒循环以及持续的向北和向西扩张。
然而，法国的WNV和USUV监测与控制仍受结构性、财政和运营约束的限制，阻碍了早期检测和快速干预。与伊蚊（Aedes）传播的病毒不同，法国缺乏针对库蚊传播的WNV和USUV的综合风险预防与管理框架。作为欧盟层面的法定报告疾病，WNV监测通常在确诊马属动物或人类病例报告后才启动。这种反应性监测方式提供的病毒存在指标往往滞后。在可能未被检测到的低水平病毒循环背景下，当前对确诊或疑似WNV风险的反应往往依赖紧急成蚊灭杀或非靶向预防性幼虫处理，成本可达数百万。因此，改进WNV和USUV的早期灵敏检测，可支持更及时和有针对性的媒介控制干预，同时减少对昂贵反应性措施的依赖。
二、研究目的与意义
研究人员开发并评估了一种创新的综合环境监测策略，将蚊虫排泄物分子监测（molecular xenomonitoring，MX）与湿地和蚊虫孳生水体的环境水样分析相结合，通过高灵敏度的多重数字PCR（digital PCR，dPCR）检测WNV和USUV RNA。该研究的核心假设是：病毒基因组预期在春季首先在水体中检出——通过感染候鸟的排泄引入——随后随着蚊虫活动增加和动物间传播循环建立，在参与这些嗜鸟性循环的本地蚊虫种群中检出病毒，先于溢出事件及随之发生的人类或马属动物病例。2024年的现场评估旨在优化检测系统并建立概念验证，2025年则将该方法区域化部署，评估其在虫媒病毒监测中的性能和相关性。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下几项关键技术方法：
- 1.
多重数字PCR检测体系：开发了同时定量WNV和USUV的多重dPCR检测方法。WNV检测靶向5‘-UTR区域，USUV检测靶向NS1区域。引物经重新设计以提高特异性，通过MUSCLE序列比对和Primer3设计，并使用BLAST进行计算机模拟特异性评估，覆盖980余条WNV序列，确保理论上可检测主要流行毒株（包括谱系1和2）。多重体系中还包含多物种蚊虫标志物（“pan-mosquito”）作为流程对照，以及外源RNA抑制对照。实验特异性通过多种病毒（包括登革病毒1-4型、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、甲肝病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A/B、SARS-CoV-2、甲型流感病毒、H5N1禽流感病毒和诺如病毒GI/GII）的交叉反应测试验证。dPCR分析使用QIAcuity平台，实现无需外部校准曲线的绝对定量。
- 2.
蚊虫排泄物样本处理：使用配备3D打印MX适配器的BG-Pro或BG-Sentinel诱捕器采集蚊虫排泄物。适配器内放置含10%蜂蜜水的棉球为捕获蚊虫提供营养，底部放置10 μm厚铝箔环收集排泄物。优化了核酸提取方案，将含蚊虫排泄物的铝箔收集器在VXL裂解缓冲液中室温孵育并涡旋5分钟，随后使用Indimag Pathogen Kit进行自动化核酸提取。
- 3.
环境水样处理：从湿地和人工孳生水体采集水样，使用优化的核酸提取方案，该方案源自一项专利工作流程，增加了预处理步骤以改善与悬浮固体相关的病毒颗粒回收。比较测试确认了优化方案的回收率改善。
- 4.
测序验证：对低水平阳性样本进行Sanger测序以确认dPCR信号特异性；对高病毒载量样本进行全基因组测序以确定循环病毒谱系。
四、研究结果
4.1 多重dPCR检测体系的开发与表征
计算机模拟验证确认了WNV 5’-UTR靶区域的高度保守性，覆盖谱系1和2。设计的寡核苷酸扩增WNV 105 bp片段和USUV 88 bp片段。各检测系统在单重检测中特异性扩增各自阳性对照，未产生非靶标病毒信号，WNV和USUV之间及与其他测试病毒均无交叉反应。多重检测中各靶标定量较单重检测下降不超过10%，确认同时检测不损害灵敏度或准确性。
抑制测试显示，蚊虫排泄物样本无PCR抑制剂，选择最大输入体积8 μL以获得最高分析灵敏度；而环境水样存在基质诱导抑制，选择保守的4 μL输入体积以保证准确定量。
4.2 分析性能表征
空白限（LoB）对所有检测系统均较低，可清晰区分真阳性反应和假阳性事件。WNV和USUV的绝对检测限（LoD）均为每反应0.125拷贝，显示极高的分析灵敏度。WNV、USUV和pan-mosquito靶标的绝对定量限（LoQ）均为每反应1.25拷贝，满足重复性（RSDr≤25%）和准确性（±30%）的预定标准。研究遵循dMIQE 2020指南。
4.3 水样核酸提取方案的优化
优化方案在加标USUV样本和孳生地样本的pan-mosquito靶标检测中均较专利方法获得更高检出水平，表明优化工作流程对病毒和蚊虫来源核酸的回收和检测效率均有改善。稳定性测试显示核酸提取后15天内WNV和pan-mosquito定量无下降。
4.4 测序确认与谱系鉴定
两年采样期间，7个样本（2个MX样本、5个捕获蚊虫）提供了足够病毒载量进行全基因组测序，所有序列均属于谱系2。Sanger测序对低水平阳性样本提供了独立双重确认，排除了引物二聚体或非特异性扩增。扩增子中与USUV最分歧的区域完全解析，核苷酸一致性符合WNV而非USUV，排除了交叉扩增。所有阴性对照均无扩增，确认无污染。
4.5 2024年运营概念验证
2024年共采集508个水样样本，安装302个MX诱捕器。WNV在11个不同市镇的蚊虫排泄物和水中检出29次。重复采样点中，139个MX诱捕器中9个阳性，171个湿地水样中8个阳性，浓度分别高达2.2×105和9.8×102拷贝/mL。最早WNV检出为2024年7月1日。USUV在6个市镇检出9次，首次检出为7月9日。WNV和USUV在多个位点同时检出。在部门尺度上，WNV在湿地水样中的检出较Gard省首例马属动物警报提前60天、较Hérault省提前67天，较Gard省首例人类血液检出提前35天，较Gard省首例本地获得性人类病例通报提前50天、较Hérault省提前67天。
4.6 2025年区域监测实际应用
2025年部署了覆盖奥克西塔尼大区约200 km地中海海岸线的45个湿地和11个MX诱捕器网络。WNV在705个水样中检出76次，来自40个不同位点，检出高峰在4月和5月，浓度最高达1,984拷贝/mL。MX样本中WNV检出14次，8月和9月达到峰值，浓度最高达4.9×105拷贝/mL。USUV在水样中检出11次，在蚊虫排泄物中检出2次。在部门尺度上，水样检出较Hérault省首例本地获得性人类病例警报提前33天；较Hérault省首例马属动物病例提前9周，较Gard省提前17周。Aude和Pyrénées-Orientales省未发出任何警报。
五、讨论与结论
研究人员开发的综合监测策略在2024和2025年传播季节实现了WNV和USUV的早期和重复检出，分别在22个市镇检出WNV 29次和90次、USUV 8次和14次。两年中WNV均在本地获得性人类病例或马属动物警报前数周被识别，凸显了显著的时序优势。
与已发表的RT-qPCR检测方法（WNV LoD约1.5-15拷贝/反应，USUV约11-50拷贝/反应）相比，该dPCR系统的LoD为0.125拷贝/反应，体现了dPCR在绝对定量和基于分区的检测方面的固有优势。优化水样工作流程改善了不溶性组分的回收，因为包膜病毒可能与悬浮固体结合。dPCR对部分抑制的耐受性优于qPCR，但仍需针对基质进行优化。2024年观察到的WNV阳性蚊虫池与阴性MX样本的差异可能反映了初始MX提取工作流程的回收效率较低，而非生物学不一致；优化方案提高了分析灵敏度，2025年未再观察到该差异。
环境水样中的检出通常较同一地理区域内蚊虫排泄物中的检出提前数周，反映了水生环境整合多种潜在病毒来源的能力，包括鸟类排泄和腐烂、禽类排毒或蚊虫排泄物，可作为本地病毒循环的早期指标。水基筛查可促进传播热点的早期定位，而伴随的MX监测可加强媒介参与的推断，并实现病毒测序和谱系鉴定。
研究提出了一种可扩展、适合现场的操作框架，支持领土决策，建议三级信号解读：（i）单次高于LoB/LoD的低水平检出提示确认性重新采样和本地风险评估；（ii）重复检出或多基质信号触发地理靶向预防措施；（iii）持续数周的信号支持升级领土准备和综合One Health监测。
研究也承认若干局限性：环境基质的物理化学异质性限制了提取方案的标准化；短扩增子（<105 bp）无法直接从水中进行系统发育谱系表征；2024和2025年运动设计差异限制年际检出率直接比较；建立环境病毒检出与人类或动物群体溢出之间的因果关系超出本研究范围。研究人员指出，该方法仍需与常规监测系统进行正式的成本效益定量评估，以确定其提供有意义运营效益的条件。
六、研究结论
该研究开发的多矩阵环境监测策略——结合水基监测与蚊虫粪便分子监测——为库蚊传播虫媒病毒的早期检测提供了灵敏、前瞻性的框架，能够揭示常规反应性监测系统无法检测到的隐秘病毒循环，为公共卫生干预和靶向媒介控制提供实质性提前时间，支持在流行和新发地区实现更具预测性的风险评估和响应能力，是One Health应对的关键推动因素。
