《Frontiers in Neuroscience》：Nicotine and tobacco smoke reshape neuronal signaling networks from a single-nucleus transcriptomic perspective
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尼古丁和香烟烟雾暴露显著影响大脑功能，但其独特的细胞和分子机制仍不清楚。为此，研究人员对成年C57BL/6小鼠在尼古丁或烟雾暴露后的全脑样本以及特异性针对腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）进行了全面的单核RNA测序（singl
尼古丁和香烟烟雾暴露显著影响大脑功能，但其独特的细胞和分子机制仍不清楚。为此，研究人员对成年C57BL/6小鼠在尼古丁或烟雾暴露后的全脑样本以及特异性针对腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）进行了全面的单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）分析。该研究在全脑中鉴定出18个主要的转录上不同的细胞群体，并在VTA内鉴定出27个不同的细胞簇，涵盖了主要的神经元和胶质细胞类型。差异基因表达和KEGG通路富集分析揭示了不同的转录响应：尼古丁暴露与神经元群体（包括多巴胺能和谷氨酸能通路）中突触和成瘾相关转录通路的富集有关，而烟雾暴露则与代谢、免疫和内分泌相关通路的更广泛富集有关。CellChat预测了与条件相关的通讯差异，包括在尼古丁暴露下，从兴奋性神经元到少突胶质细胞和其他兴奋性神经元的推断性NRXN通讯增加。烟雾暴露也增加了少突胶质细胞中的PISD表达，这是一种可能与线粒体磷脂代谢相关的转录组变化。总的来说，这些数据定义了尼古丁和烟雾暴露的细胞类型特异性转录和预测性通讯特征，这些特征需要功能性验证。
研究背景与目的
尼古丁是烟草的主要成瘾成分，通过调节涉及奖赏、动机和强化的神经回路对中枢神经系统产生深远影响。腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）作为中脑边缘多巴胺系统的关键区域，在介导这些效应中起着核心作用。尽管先前的研究探索了尼古丁对VTA的影响，但尼古丁诱导神经适应的精确细胞和分子机制仍未完全阐明。此外，与纯化的尼古丁暴露不同，整个香烟烟雾是一种包含众多相互作用成分的复杂混合物，使得难以将观察到的转录反应归因于任何单一成分。因此，本研究旨在利用单核RNA测序技术，全面描绘尼古丁和香烟烟雾暴露后小鼠大脑（特别是VTA）的转录组图谱，以揭示这两种暴露方式在细胞和分子层面的异同。
研究方法与技术路线
研究人员使用了C57BL/6小鼠，分别进行尼古丁皮下注射（1 mg/kg/天，连续14天）和主流香烟烟雾全身暴露（颗粒物浓度1000 mg/m3，每天2小时，连续14天）。随后，对每组3只小鼠的全脑和3只小鼠的VTA组织分别混合后进行单核分离和snRNA-seq文库构建（使用10× Genomics平台）。数据分析流程包括：使用Cell Ranger处理原始数据，Seurat进行质量控制、降维聚类和差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析（Wilcoxon秩和检验，|log2FC| > 0.25, 校正p值 < 0.05），clusterProfiler进行KEGG通路富集分析，以及CellChat进行细胞间通讯推断。
研究结果
1. 单核转录组图谱绘制揭示了尼古丁和烟雾暴露下的主要脑细胞类型
通过对全脑样本进行联合分析，研究人员获得了26,752个高质量细胞核，并识别出18个转录上不同的细胞簇。利用经典标志基因对这些簇进行注释，涵盖了兴奋性神经元（如Slc17a7+）、抑制性神经元（如Gad1+）、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞等主要脑细胞类型。这建立了成年小鼠大脑在尼古丁和烟雾暴露下的单核转录组图谱。
2. 尼古丁和烟雾暴露与不同的推断性细胞间通讯及NRXN相关模式相关
CellChat分析显示，尼古丁暴露与更高的推断性NRXN（neurexin，轴突蛋白）通路信息流相关，其中兴奋性神经元（簇0）是主要的预测发送者，而少突胶质细胞（簇1）和其他兴奋性神经元（簇3）是主要的接收者。相比之下，烟雾暴露显示出涉及细胞外基质和免疫相关通路的独特推断性通讯谱，并且NRXN信息流较低。
3. 烟草烟雾暴露后少突胶质细胞特异性转录反应和PISD诱导
差异表达基因分析发现，抑制性神经元和少突胶质细胞在两种暴露条件下均表现出最显著的转录反应，尤其是烟雾暴露导致少突胶质细胞中上调基因数量大幅增加。KEGG分析表明，烟雾暴露后少突胶质细胞的差异表达基因富集于甲状腺激素合成、催产素信号、cAMP-PKG信号等神经内分泌和代谢相关通路。值得注意的是，在烟雾暴露的少突胶质细胞中，PISD（phosphatidylserine decarboxylase，磷脂酰丝氨酸脱羧酶）表达显著上调，这是一种与线粒体磷脂代谢相关的转录组学特征。
4. 小鼠VTA的单核RNA测序揭示了对照、尼古丁和烟雾暴露下的多样神经元和胶质细胞群体
对微解剖的VTA组织进行snRNA-seq，共获得29,775个高质量细胞核，并识别出27个转录上不同的细胞簇。这些簇包括兴奋性神经元、抑制性神经元、少突胶质前体细胞、成熟少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，证实了VTA高度的细胞异质性。
5. 基于经典神经递质标志物特征的VTA神经元亚群表征
通过对VTA神经元进行再聚类，研究人员识别出17个转录上不同的神经元亚群。基于多巴胺能（如Th, Slc6a3）、谷氨酸能（如Slc17a6）和GABA能（如Gad1, Gad2）的标志基因表达谱，将这些亚群分为多巴胺能、谷氨酸能和GABA能神经元，并观察到一些簇呈现混合神经递质标志物表达的特征。
6. 尼古丁和烟雾暴露在VTA神经元中诱导了不同的转录组特征
差异表达基因分析显示，一个主要由GABA能神经元组成的混合神经元簇（簇0）在两种暴露条件下都表现出最多的转录改变。KEGG通路分析表明，尼古丁暴露后富集的通路包括溶酶体、吞噬体、铁死亡、Hippo和cAMP信号等；而烟雾暴露后则富集了MAPK、钙离子、PI3K-Akt信号、核糖体生物发生、神经退行性疾病等通路。氧化磷酸化等能量代谢相关通路在两种暴露条件下均有富集。
7. 尼古丁和烟雾暴露下VTA神经元中推断的细胞间通讯模式
CellChat分析揭示了VTA中与条件相关的推断性细胞间通讯差异。尼古丁暴露后，簇0显示出较高的推断性传出通讯强度。在通路水平上，尼古丁暴露与NRXN和ADGRE等通路的较高推断性信息流相关，而烟雾暴露则与WNT、MIF、ANGPTL和IL6等通路的较高信息流相关。
讨论与结论
本项研究提供了一个全面的单核转录组图谱，揭示了尼古丁和香烟烟雾暴露后小鼠大脑的细胞类型特异性转录反应和预测性细胞间通讯变化。研究发现，NRXN通路是全脑范围内尼古丁和烟雾暴露后推断性细胞间通讯发生显著变化的通路之一，这与先前关于NRXN3基因多态性与物质依赖关联的遗传学研究相呼应。在VTA层面，研究详细描绘了其细胞组成，并揭示了尼古丁和烟雾暴露引发的重叠但又有区别的神经元转录反应：尼古丁暴露与突触和成瘾相关通路注释的富集有关，而烟雾暴露则与更广泛的免疫和代谢相关转录本及通路的富集有关。这些发现强调了在研究烟草成瘾时考虑整个烟雾复杂性的重要性。研究结论指出，这些数据定义了需要进一步功能验证的、与尼古丁和烟雾暴露相关的细胞类型特异性转录和预测性通讯特征。然而，该研究也存在局限性，例如由于样本混合导致缺乏独立的生物学重复，因此所有结果，特别是CellChat的预测，都应被视为探索性和描述性的，而非功能活性的直接证据。
