《Frontiers in Behavioral Neuroscience》：eeeHive: a new HF RFID-based automated behavioral monitoring system enabling high spatiotemporal resolution tracking of group-housed animals
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利用射频识别（RFID）技术对群居社会性动物进行长期自动化追踪是行为神经科学领域一种极具前景的方法。然而，低频（LF）RFID虽在该领域长期应用，却受限于其固有的低数据传输速率，导致两个关键局限性：（1）时空分辨率受损，（2）无法同时识别多个标签（动物）。为解
利用射频识别（RFID）技术对群居社会性动物进行长期自动化追踪是行为神经科学领域一种极具前景的方法。然而，低频（LF）RFID虽在该领域长期应用，却受限于其固有的低数据传输速率，导致两个关键局限性：（1）时空分辨率受损，（2）无法同时识别多个标签（动物）。为解决这些局限，研究人员开发了eeeHive——一种基于高频（HF）RFID的动物追踪系统，该系统采用完全定制的硬件架构，能够实现高速、多路复用的天线轮询及并发多标签读取。eeeHive中每根天线的轮询时间为5.9毫秒，每个标签的额外读取时间为8.2毫秒。研究人员将该系统应用于对24只小鼠进行为期一周的追踪，以及对六只普通狨猴进行为期七周的追踪。该系统即使在密集集群中也能成功追踪个体，揭示出以空间利用、时间动态、行为规律性和个体间关系为特征的复杂行为性状。在日本火腹蝾螈和尼罗罗非鱼幼鱼上的附加测试表明，该系统在水生环境中具有可比的追踪性能。综上，eeeHive克服了传统LF RFID的内在局限，建立了一个强大的基于HF RFID的平台，用于对陆生和水生物种的群养动物进行精细尺度行为追踪。
一、研究背景与问题提出
在神经科学与神经药理学领域，实验动物模型的多样性与可获得性在过去二十年显著增加。然而，如何在实验室环境中可靠地解读动物行为仍是一个持续性挑战。传统的啮齿类动物行为测试范式通常涉及将动物从饲养笼中手动转移至隔离的测试箱中进行短期观察，这种“封闭式”程序因忽视了人为干预的影响以及各物种或品系特有的感觉与行为特征而受到批评。为解决此问题，自动家庭笼监测（automated home-cage monitoring, AHCM）的概念应运而生，它能够在不受干扰的条件下对动物在其生活环境中的行为进行长期观测，从而捕获更丰富的行为谱系。在众多AHCM方法中，射频识别（radio frequency identification, RFID）已成为在群养环境中进行可靠个体识别和精确行为追踪的广泛采用技术。然而，当前多天线动物追踪系统普遍采用的低频（low-frequency, LF）RFID（通常在ISO 11784/11785 FDX-B协议下工作于134.2 kHz）存在固有缺陷：其一，低数据速率导致系统时空分辨率受限；其二，无法在同一天线场内同时识别多个标签（即标签碰撞）。这些限制严重阻碍了对诸如快速移动和紧密聚集的小鼠等动物的行为分析。相比之下，高频（high-frequency, HF）RFID（工作于13.56 MHz）具有更高的数据速率和内置的防冲突机制，理论上可以克服上述局限。因此，本研究旨在开发并验证一种兼容ISO/IEC 15693标准的新型HF RFID动物行为追踪系统——eeeHive。
二、研究方法与技术路线
为验证HF RFID在动物行为追踪中的可行性，研究人员开发了名为eeeHive的全定制硬件系统。该系统采用天线复用配置，由阅读器、天线复用器、多根阅读器天线和一台主机组成。系统提供两种硬件模块：用于二维高精度追踪的“2D模块”，包含一块200 mm × 300 mm的电路板，其上排列有24个50 mm见方的瓷砖型线圈天线，形成4×6网格；以及允许灵活布置天线的“FLEX模块”，最多可连接24根定制形状和尺寸的天线（本研究中用于狨猴和罗非鱼的环形天线）。所有动物实验均使用符合ISO/IEC 15693标准的圆柱形生物相容玻璃封装标签（直径2.12 mm，长12 mm）。数据处理与分析使用Python语言及其相关库完成。为评估个体间行为指标是否超出随机水平，采用了置换检验（permutation test），主要通过10分钟块循环移位方法生成零分布，并计算观测值与期望值的比值（O/E ratio）和Z分数。
三、主要研究结果
3.1 eeeHive 2D和FLEX模块的标签读取性能
通过对2D模块瓷砖型天线的15400种空间条件组合进行评估，发现即使标签线圈开口与天线正交（仰角近0°），在2 mm垂直距离下读取覆盖率仍达76%；随着仰角增大至接近垂直，可读垂直距离可达40 mm。对于FLEX模块的环形天线，模拟标签垂直穿过线圈时，最大读取距离同样约为40 mm。在淡水和3.5% NaCl溶液中的测试显示，读取范围几乎不受影响。在速度方面，无标签时24根天线的总轮询周期时间（polling cycle time, PCT）为142 ms（每根天线5.9 ms），每个标签的额外读取时间为8.2 ms。单个天线场内的防冲突算法会增加约30 ms延迟，但总体影响有限。
3.2 使用eeeHive 2D模块对小鼠进行行为追踪
在24只雄性C57BL/6J小鼠的7天连续记录中，平均每秒检测率为83.6%。活动节律分析显示，小鼠主要在暗期活动，并在光照转换时达到峰值，日均运动距离为253.3米。群体分散度指标（距质心平均距离, MDC）显示，群体在活跃期分散（约15 cm），在休息期更聚集（约8-9 cm）。空间利用分析发现，大多数小鼠偏好带有红色丙烯酸顶盖的3号房间作为“家园基地”。个体间的空间组织差异揭示了“角落占据者”（如M20）和“漫游者”（如M19）两种行为倾向。进一步分析表明，靠近角落的个体与其他个体的聚集程度更高，而漫游者的社交独立性更强。通过定义“跟随行为”（follow behavior），发现44.9%的配对表现出显著高于预期的跟随模式。主成分分析（PCA）提取了三个主成分，解释了68.2%的总方差，随后的层次聚类将24只小鼠划分为四个具有不同行为特征的集群。
3.3 使用eeeHive FLEX模块对狨猴进行行为追踪
对6只普通狨猴进行了为期7周的监测。行为日志可视化显示了个体间在暗期巢箱占用率上的显著差异。通过马尔可夫链模型分析位置转移概率，发现个体间转移熵存在差异。在光期，狨猴表现出“集群访问”巢箱的行为。研究人员操作性地定义了四种跟随相关事件：跟随进入、回避、跟随离开和追逐。对所有30个定向关系的分析显示，跟随行为和追逐行为的O/E比值均显著高于随机水平，其中雌性F1被雄性M3和M1强烈追逐。夜间巢箱共占分析显示，白天跟随行为的强度与夜间巢箱共占时间之间存在强正相关性（r = 0.94）。
3.4 eeeHive在水生环境中的应用
对4只日本火腹蝾螈和11尾尼罗罗非鱼幼鱼的研究证实了系统在水生环境中的实用性。蝾螈实验使用2D模块，成功追踪了其空间利用和个体间近距离关联。罗非鱼实验使用FLEX模块的环形天线，量化了其在两隔室间的穿梭频率、共现模式和跟随网络。
四、总结与结论
本研究成功开发并验证了eeeHive——一种基于高频RFID（HF RFID）的新型自动化行为监测系统。该系统通过采用ISO/IEC 15693标准，有效克服了传统低频RFID（LF RFID）在数据速率和多标签识别方面的固有限制，实现了更高的时空分辨率和并发多动物追踪能力。在小鼠、普通狨猴、日本火腹蝾螈和尼罗罗非鱼等多种陆生和水生物种上的应用证明，eeeHive能够可靠地捕获精细尺度的个体行为特征、群体空间动态以及复杂的社交互动网络。研究结论指出，eeeHive建立了一个强大的基于HF RFID的平台，可用于对群养动物进行精细尺度的行为追踪，为神经科学、行为生态学和药物筛选等领域提供了有力的研究工具。
