视神经乳头胶质板星形胶质细胞的力学生物学特性由Caveolin-1界定

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Caveolin-1 defines astrocyte mechanobiology in the glial lamina of the optic nerve head

　　

视神经乳头是原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma, POAG）中视网膜神经节细胞轴突损伤的主要部位，在该疾病进展过程中，星形胶质细胞的力学生物学（mechanobiology）与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑被认为发挥关键作用。小凹（caveolae）是由Caveolin和Cavin蛋白形成的机械敏感性质膜内陷结构，是细胞对机械应力反应的关键调控因子，然而其是否参与视神经乳头病理生理过程此前尚未明确。本研究在体外（in vitro）和体内（in vivo）水平表征了小鼠视神经星形胶质细胞中Caveolin和Cavin蛋白的存在、调控及力学生物学意义。原代视神经星形胶质细胞呈现典型的小凹结构，并表达Caveolin-1、Caveolin-2及多种Cavin蛋白。在体内，Caveolin-1在胶质板的星形胶质细胞中高度富集。青光眼相关因子CCN2/CTGF和TGF-β2显著上调视神经星形胶质细胞中Caveolin-1和Cavin-1的表达，而CCN2/CTGF敲低则降低Caveolin-1表达。增加基质刚度可增强Caveolin-1表达并改变其亚细胞定位。此外，在青光眼小鼠模型的视神经乳头中Caveolin-1 mRNA表达升高，而在转基因小鼠的整个视神经中其蛋白水平亦升高。综上，这些发现将小凹和Caveolin-1鉴定为视神经星形胶质细胞的机械敏感组分，并提示其参与青光眼性视神经乳头的生物力学和分子改变。该工作首次提供了将胶质板星形胶质细胞力学生物学与Caveolin-1联系起来的证据，揭示了青光眼发病机制中一个潜在的新贡献因素。

论文解读

一、研究背景与科学问题

视神经乳头是视网膜神经节细胞轴突离开眼球的必经之处，也是原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma, POAG）中轴突损伤的核心部位。在人类中，该区域包含筛板（lamina cribrosa），一种由结缔组织和弹性纤维构成的网状结构，表面覆盖密集的星形胶质细胞和筛板细胞网络；而在小鼠中，则存在一个几乎完全由星形胶质细胞组成的胶质板（glial lamina），缺乏灵长类动物中存在的结缔组织支架。筛板或胶质板的主要功能是分布和抵抗由眼内压（intraocular pressure, IOP）产生的生物力学力，从而保护神经纤维。在POAG中，轴突损伤发生于该部位并导致进行性的视网膜神经节细胞丧失，而升高的IOP是该退行性变的主要危险因素。在整个视神经乳头中，特别是在筛板或胶质板内，星形胶质细胞在POAG期间表现出显著的反应性，但这些变化最终对轴突健康是有保护性还是有害性仍不确定。随着疾病进展，层状结构的组织发生进行性改变，包括细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组分质量和数量的变化，这些变化主要由转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2, TGF-β2）等生长因子诱导，进而改变组织的生物力学特性，影响轴突和胶质细胞所暴露的力学生物学环境。

小凹（caveolae）是已知参与机械感觉和机械转导的膜结构，其主要成分为两个蛋白家族：caveolins和cavins。Caveolin-1是小凹形成所必需的蛋白，其缺失导致小凹完全消失。此前针对POAG的全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）已在7q31染色体上的CAV1和CAV2基因之间发现了与POAG显著相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs），提示Caveolin蛋白家族可能在青光眼病理中具有重要作用。然而，小凹及其相关蛋白是否参与青光眼中的视神经发病机制此前完全未知。因此，本研究旨在系统表征小鼠视神经星形胶质细胞中小凹及其蛋白的存在、调控和力学生物学意义，探索Caveolin-1作为胶质板星形胶质细胞力学传感分子的潜在角色。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用多种技术手段开展研究。主要方法包括：扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察小凹的超微结构；实时荧光定量RT-PCR（real-time RT-PCR）检测Caveolin和Cavin家族成员的mRNA表达水平；Western blot分析检测蛋白水平变化；免疫细胞化学和免疫组织化学染色用于定位Caveolin-1和Cavin-1在体外培养细胞及体内视神经组织中的分布；siRNA干扰技术用于敲低Ccn2/Ctgf和Caveolin-1的表达；腺病毒介导的Cre重组酶转导用于在Ctgf^Coin/Coin小鼠来源的星形胶质细胞中条件性敲除Ctgf；不同刚度（8-10 kPa、50-60 kPa、玻璃70 GPa）的细胞培养基底用于模拟生物力学应力环境。研究使用的动物模型包括野生型CD1小鼠、βB1-CTGF1转基因青光眼小鼠模型及其野生型同窝对照，以及Ctgf^Coin/Coin条件性敲除小鼠。原代小鼠视神经星形胶质细胞按照已发表的方案分离和培养，实验使用至第8代，所有实验均使用至少三种不同的细胞系。

三、研究结果

3.1 视神经星形胶质细胞中Caveolins和Cavins的表达与定位

利用扫描电子显微镜，研究人员在原代小鼠视神经星形胶质细胞表面观察到典型的小凹结构，其形态和大小（直径约50-100 nm，多数约60-80 nm）与脑内皮细胞系b.End5中的小凹相当。实时RT-PCR检测确认了Caveolin-1、Caveolin-2、Cavin-1、Cavin-2、Cavin-3和Cavin-4的mRNA表达，而主要在肌肉细胞中表达的Caveolin-3未被检测到。免疫细胞化学染色验证了Caveolin-1和Cavin-1蛋白在体外培养的原代视神经星形胶质细胞中的存在。在体内实验中，8周龄野生型小鼠视神经的免疫组织化学分析显示，Caveolin-1高度富集于胶质板区域，在筛板前区（prelaminar region, PRL）表达较低，而在筛板后区（postlaminar region, PSL）几乎完全缺失。与星形胶质细胞特异性标志物GFAP的共染色确认了Caveolin-1在胶质板星形胶质细胞中的强定位，同时视神经血管中也检测到强烈的Caveolin-1信号。筛板后区的弱Caveolin-1信号不与星形胶质细胞共定位，更可能来源于视神经内的小血管。

3.2 CCN2/CTGF和TGF-β2调控Caveolin-1表达和蛋白水平

研究人员用50 ng/ml或100 ng/ml的CCN2/CTGF以及1 ng/ml的TGF-β2处理原代小鼠视神经星形胶质细胞24小时。结果显示，CCN2/CTGF和TGF-β2均显著增加Caveolin-1的mRNA表达；Western blot分析进一步证实Caveolin-1蛋白水平在CCN2/CTGF（50 ng/ml和100 ng/ml）和TGF-β2处理后显著升高。对于Cavin-1，其mRNA表达在CCN2/CTGF或TGF-β2处理后未发生显著变化，但蛋白水平在CCN2/CTGF（50 ng/ml和100 ng/ml）和TGF-β2处理后显著增加。CCN2/CTGF和TGF-β2处理对Cavin-2和Cavin-3的表达无影响。通过siRNA介导的Ccn2/Ctgf敲低实验，研究人员发现Ccn2/Ctgf表达降低导致Caveolin-1 mRNA显著下降，而Cavin-1 mRNA不受影响。在Ctgf^Coin/Coin小鼠来源的星形胶质细胞中，通过腺病毒Cre转导敲低Ctgf/Ccn2后，Caveolin-1蛋白水平反而升高，而Cavin-1蛋白水平降低。

3.3 基质刚度影响Caveolin-1表达和定位

为模拟青光眼中的生物力学改变，研究人员将原代小鼠视神经星形胶质细胞培养在不同刚度的基底上。在50-60 kPa高刚度基底上培养的细胞，其Caveolin-1 mRNA表达显著高于在8-10 kPa软基底上培养的细胞。免疫细胞化学染色显示，在50 kPa基底上，Caveolin-1在细胞质和细胞膜上分布较为均匀；而在玻璃基底（70 GPa）上，Caveolin-1染色呈现更明显的点状分布，倾向于在黏着斑（focal adhesion）附近聚集，并与Vinculin染色部分重叠。定量分析确认，在玻璃基底上培养的星形胶质细胞中Caveolin-1免疫荧光标记的相对面积百分比显著高于50 kPa基底上的细胞。此外，在8-50 kPa刚度范围内，siRNA介导的Caveolin-1敲低后，胶原IV蛋白水平呈升高趋势，pFAK/FAK蛋白比值也呈升高趋势。

3.4 青光眼小鼠模型中Caveolin-1的失调

在βB1-CTGF1青光眼小鼠模型中，实时RT-PCR分析显示视神经乳头组织中Caveolin-1 mRNA表达较野生型同窝对照显著升高，而整个视神经组织中的Caveolin-1 mRNA表达无显著差异。然而，Western blot分析表明，转基因小鼠的整个视神经组织（包括视神经乳头）中Caveolin-1蛋白水平较野生型同窝对照显著升高。

四、讨论与结论

本研究首次将胶质板星形胶质细胞的力学生物学与Caveolin-1联系起来。研究结果表明，小凹及其核心蛋白Caveolin-1可能通过以下机制参与青光眼性视神经乳头的病理改变：其一，视神经星形胶质细胞表达全套小凹形成所需的Caveolin和Cavin蛋白并形成典型小凹结构；其二，Caveolin-1在体内几乎特异性定位于胶质板星形胶质细胞；其三，青光眼相关因子CCN2/CTGF和TGF-β2可上调Caveolin-1和Cavin-1的表达水平；其四，基质刚度增加可增强Caveolin-1表达并改变其亚细胞定位，使其向黏着斑附近聚集；其五，青光眼小鼠模型的视神经乳头中Caveolin-1表达升高。

讨论部分指出，视神经乳头星形胶质细胞直接与巩膜周围组织接触，能够感知周围环境刚度的变化，从而可能将巩膜壁张力直接传递给通过的视神经轴突。小凹通过扁平化机制缓解急性机械应力引起的膜张力增加，而Caveolin-1在多种细胞类型中被证实参与机械传感过程。CCN2/CTGF与Caveolin-1之间的双向调控关系提示可能存在一个正反馈环路：力学负荷诱导CCN2/CTGF表达，CCN2/CTGF上调Caveolin-1，而Caveolin-1又作为力学传感器参与CCN2/CTGF驱动的ECM重塑。此外，Caveolin-1和Cavin-1是YAP/TAZ-TEAD的直接靶基因，进一步将小凹动力学与ECM依赖性机械转导联系起来。在Caveolin-1敲除小鼠中，星形胶质细胞在缺血性卒中后形成胶质瘢痕的能力降低，野生型小鼠的恢复优于敲除小鼠，提示Caveolin-1可能具有神经保护功能。既往研究还表明，Caveolin-1缺失导致IOP升高和房水引流减少，且流出通路细胞对急性IOP升高的破裂敏感性增加。然而，Caveolin-1在青光眼视神经乳头中的增加究竟是保护性还是有害性反应，尚需进一步研究阐明。

综上所述，本研究得出结论：小凹和Caveolin-1是视神经星形胶质细胞的机械敏感组分，参与青光眼性视神经乳头的生物力学和分子改变，为青光眼发病机制提供了一个潜在的新贡献因素。