N端分化介导PKLR p.Arg426Gln突变在PKR与PKL亚型中的差异化致病机制

《Cell Communication and Signaling》：Functional analysis of PKLR p.Arg426Gln reveals isoform-specific aberrant PKR phosphorylation and PKL metabolic reprogramming

　　

摘要

背景

丙酮酸激酶缺乏症（PKD）是一种由PKLR基因突变引起的常染色体隐性遗传性溶血性贫血，该基因编码两种组织特异性亚型：红细胞特异性PKR和肝细胞特异性PKL。尽管这些亚型共享一个共同的催化核心并在N端存在差异，但N端的分化如何塑造亚型特异性致病机制并导致PKD的系统性表现仍不清楚。在此，我们调查了一个携带纯合PKLR变异体NM_000298.6:c.1277G?>?A（p.Arg426Gln）的PKD家系，以确定其对PKR和PKL的亚型特异性影响。

方法

对患者和健康对照进行转录组和蛋白质组学分析，以鉴定与突变相关的通路扰动。机制研究采用亚型特异性细胞模型（HEK293T用于PKR-R426Q，THLE-2用于PKL-R395Q）、定点突变、生化分析和非靶向脂质组学。斑马鱼研究结合了人PKLR mRNA表达、药物挽救以及CRISPR/Cas9介导的内源性pklr破坏，随后用人PKLR-WT或PKLR-R426Q mRNA进行挽救。

结果

p.Arg426Gln突变的结构功能分析揭示了与N端分化相关的PKR和PKL特异性致病性变化。具体而言，PKR-R426Q以PI3K非依赖性方式激活了PDPK1和JAK2/STAT3信号通路，伴随AKT1激活增加以及涉及PKR特异性N端S26位点的异常磷酸化。这些改变伴随PKR活性降低、糖酵解障碍和MAPK抑制，并通过通路导向的药物干预在细胞模型和人PKLR-R426Q mRNA过表达的斑马鱼胚胎中部分得到改善。在人PKLR-R426Q mRNA过表达的斑马鱼胚胎中观察到的糖酵解和红细胞表型进一步得到CRISPR/Cas9介导的内源性pklr破坏的互补遗传学证据支持，其中相应的缺陷被人类PKLR-WT mRNA挽救但未被PKLR-R426Q mRNA挽救。相反，同源PKL-R395Q突变表现出磷酸化非依赖性的代谢重编程、线粒体功能障碍和脂质失调。AG-348改善了细胞模型和斑马鱼模型中与PKR和PKL相关的功能异常。

结论

功能分析表明，N端分化对PKLR p.Arg426Gln在PKR和PKL亚型中的不同致病性后果有贡献。该突变似乎主要通过异常磷酸化相关机制损害PKR功能，而PKL功能障碍则与磷酸化非依赖性的代谢重塑有关。这些发现为PKD的基因型-表型相关性提供了见解，并突出了可能需要进一步进行治疗研究的信号通路和代谢通路。

背景

丙酮酸激酶缺乏症（PKD）是一种由PKLR基因突变引起的常染色体隐性遗传性解性贫血，该基因编码两种组织特异性亚型：红细胞特异性PKR和肝细胞特异性PKL。尽管这些亚型共享一个共同的催化核心并在N端存在差异，但N端的分化如何塑造亚型特异性致病机制并导致PKD的系统性表现仍不清楚。在此，我们调查了一个携带纯合PKLR变异体NM_000298.6:c.1277G?>?A（p.Arg426Gln）的PKD家系，以确定其对PKR和PKL的亚型特异性影响。

方法

对患者和健康对照进行转录组和蛋白质组学分析，以鉴定与突变相关的通路扰动。机制研究采用亚型特异性细胞模型（HEK293T用于PKR-R426Q，THLE-2用于PKL-R395Q）、定点突变、生化分析和非靶向脂质组学。斑马鱼研究结合了人PKLR mRNA表达、药物挽救以及CRISPR/Cas9介导的内源性pklr破坏，随后用人PKLR-WT或PKLR-R426Q mRNA进行挽救。

结果

p.Arg426Gln突变的结构功能分析揭示了与N端分化相关的PKR和PKL特异性致病性变化。具体而言，PKR-R426Q以PI3K非依赖性方式激活了PDPK1和JAK2/STAT3信号通路，伴随AKT1激活增加以及涉及PKR特异性N端S26位点的异常磷酸化。这些改变伴随PKR活性降低、糖酵解障碍和MAPK抑制，并通过通路导向的药物干预在细胞模型和人PKLR-R426Q mRNA过表达的斑马鱼胚胎中部分得到改善。在人PKLR-R426Q mRNA过表达的斑马鱼胚胎中观察到的糖酵解和红细胞表型进一步得到CRISPR/Cas9介导的内源性pklr破坏的互补遗传学证据支持，其中相应的缺陷被人类PKLR-WT mRNA挽救但未被PKLR-R426Q mRNA挽救。相反，同源PKL-R395Q突变表现出磷酸化非依赖性的代谢重编程、线粒体功能障碍和脂质失调。AG-348改善了细胞模型和斑马鱼模型中与PKR和PKL相关的功能异常。

结论

功能分析表明，N端分化对PKLR p.Arg426Gln在PKR和PKL亚型中的不同致病性后果有贡献。该突变似乎主要通过异常磷酸化相关机制损害PKR功能，而PKL功能障碍则与磷酸化非依赖性的代谢重塑有关。这些发现为PKD的基因型-表型相关性提供了见解，并突出了可能需要进一步进行治疗研究的信号通路和代谢通路。