桑叶、葡萄叶与橄榄叶冻干提取物的植物化学成分、抗氧化活性及协同α-淀粉酶抑制动力学体外评价

《Food Production, Processing and Nutrition》：In vitro evaluation of the phytochemical composition, antioxidant potential, and synergistic α-amylase inhibition kinetics of combined plant leaf freeze-dried extracts

　　

摘要专业翻译 管理2型糖尿病（T2DM）的关键策略之一是抑制α-淀粉酶，以减缓复杂碳水化合物的消化并控制血糖水平。本研究评估了桑（Morus alba L.，Ma）、葡萄（Vitis vinifera L.，Vv）和橄榄（Olea europaea L.，Oe）冻干叶提取物及其不同比例二元和三元组合对α-淀粉酶活性的体外抑制效果。干燥叶片经粉碎后，使用两种乙醇-水比例（60:40和80:20，v/v）的水合乙醇以1:20（w/v）的料液比搅拌提取1小时。研究人员选取多酚含量最高的粗水合乙醇提取物进行后续冻干处理。对乙醇提取物和冻干提取物进行了总多酚含量、总黄酮含量以及DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼基）和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）法抗氧化活性的分析。采用高效液相色谱（HPLC）对各冻干提取物的酚类图谱进行了检测。利用3,5-二硝基水杨酸比色法评估冻干提取物的α-淀粉酶抑制潜力，以确定IC50值（使酶活性降低50%所需的抑制剂浓度）。此外，研究人员以固定比例测试了提取物组合，并通过计算组合指数（CI）表征其相互作用以评估潜在协同效应。动力学分析表明，植物提取物通过非竞争性机制抑制α-淀粉酶，与阿卡波糖的竞争性抑制作用形成对比。组合指数（CI）值表明，Vv与Oe叶提取物的组合在所有测试比例下均持续产生协同效应，这对增强抑制活性极为有利。以Vv和Oe提取物各自IC50值的75%和25%制备的二元混合物实现了97.77%的抑制率，CI=0.16。同时，由Ma、Vv和Oe提取物各自IC50值的25%、50%和25%组成的三元混合物实现了81.77%的抑制率，CI=0.51。

论文解读

一、研究背景与意义

2型糖尿病（T2DM）是最常见的代谢性疾病形式，以持续性高血糖为特征。世界卫生组织预测，到2030年糖尿病将成为全球第七大死亡原因。控制餐后高血糖的关键治疗策略之一是抑制α-淀粉酶（E.C.3.2.1.1），该酶负责水解淀粉和糖原中的α?1,4糖苷键，将其分解为寡糖，进而由α-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.20）进一步加工为可吸收的葡萄糖。然而，现有的药物抑制剂如阿卡波糖和米格列醇虽然有效，但会引起胃肠道副作用——未被消化的淀粉进入下消化道后被肠道菌群异常发酵，导致腹泻和腹痛。此外，美国食品药品监督管理局（FDA）已将阿卡波糖列入其药物性肝损伤毒性及严重程度数据集。因此，研究越来越聚焦于药用植物的天然替代方案。

桑（Morus alba L.）叶多酚具有抗氧化、抗肥胖、抗炎、降压、抗动脉粥样硬化、降血糖和心脏保护等积极作用；葡萄（Vitis vinifera L.）叶中的多酚化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗糖尿病、心脏保护和抗菌特性；橄榄（Olea europaea L.）叶提取物中的多种植物化学物质具有抗癌、抗氧化、抗菌和抗糖尿病潜力。三种植物叶提取物各自的α-淀粉酶抑制活性已有单独研究，但将其组合以产生广谱多酚复合物并增强α-淀粉酶抑制潜力的研究尚属空白。本研究正是基于三种植物各自独特的植物化学特征——Ma叶富含芦丁和绿原酸（均为已证实的α-淀粉酶抑制剂），Vv叶富含儿茶素（可通过氢键与α-淀粉酶活性位点结合），Oe叶富含橄榄苦苷（通过氢键展现独特的α-淀粉酶抑制模式）——将它们组合以靶向更广泛的酶结合位点，探索协同增效的创新途径。

二、主要技术方法

研究人员从埃及吉萨的一个农场采集了Ma、Vv和Oe三种植物叶片，标本凭证存放于吉萨马扎尔植物园标本馆（编号分别为EGY-MAZHAR02240201、EGY-MAZHAR03250523和EGY-MAZHAR03010311）。叶片在40°C干燥至恒重后粉碎过筛（粒径0.29 mm）。采用两种乙醇-水比例（60:40和80:20，v/v）以1:20（w/v）料液比搅拌提取1小时获得粗水合乙醇提取物，选取多酚含量最高的提取物浓缩后冻干。分析手段包括：Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（TPC）、氯化铝法测定总黄酮含量（TFC）、DPPH和FRAP法评估抗氧化活性、高效液相色谱（HPLC）分析酚类化合物组成、3,5-二硝基水杨酸（DNSA）比色法测定α-淀粉酶抑制活性、Lineweaver-Burk双倒数作图分析抑制动力学类型、以及基于Chou-Talalay中位效应原理计算组合指数（CI）评估协同作用。

三、研究结果

乙醇浓度对提取率的影响：60%乙醇的提取率（19.21%–29.53%）显著高于80%乙醇（15.33%–24.28%），表明提取率与溶剂含水量成正比。Oe在两种乙醇浓度下均表现出最高的提取率，其次为Ma和Vv。

乙醇浓度对植物化学含量的影响：80%乙醇提取物的总酚和总黄酮含量显著高于60%乙醇提取物，表明80%乙醇对叶片多酚的提取效率更高。TPC范围为Ma（60%乙醇）的18.26±0.43至Oe（80%乙醇）的103.98±1.24 mg GAE/g干叶，TFC范围为Ma（60%乙醇）的6.71±0.14至Oe（80%乙醇）的84.88±0.79 mg QE/g干叶。因此，80%乙醇提取物被选用于冻干。

乙醇浓度对抗氧化活性的影响：基于DPPH和FRAP两种测定结果，80%乙醇提取物在所有植物来源中均表现出最高的抗氧化活性（最低的IC₅₀和EC₅₀值）。抗氧化活性排序为Oe > Vv > Ma。Vv和Oe乙醇提取物的抗氧化活性显著高于阳性对照BHT（p<0.05）。

冻干高多酚提取物的评估：冻干提取物（FDE）的TPC和TFC分别介于55.21±0.4至280.67±5.51 mg GAE/g FDE和29.58±0.24至183.52±1.26 mg QE/g FDE之间。Oe冻干提取物的TPC和TFC均为最高，其次为Vv和Ma。所有FDE的抗氧化活性均显著高于BHT，其中Oe冻干提取物的抗氧化活性约为BHT的10倍。

HPLC分析：共鉴定并定量了14种酚类化合物和7种黄酮类化合物。Ma提取物中原儿茶酸、绿原酸、丁香酸、阿魏酸、芥子酸和芦丁含量显著高于其他提取物，绿原酸和咖啡酸为主要酚酸，芦丁为主要黄酮。Vv FDE中没食子酸、对羟基苯甲酸、迷迭香酸和儿茶素浓度最高，迷迭香酸和咖啡酸为主要酚酸，儿茶素为主要黄酮。Oe叶提取物中香草酸、肉桂酸、橄榄苦苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、山柰酚和白杨素的浓度统计上最高，橄榄苦苷为主要酚类化合物，芹菜素-7-葡萄糖苷为主要黄酮。

冻干提取物对α-淀粉酶的体外抑制效果：Ma提取物表现出最强的α-淀粉酶抑制效果（IC₅₀=4.53±0.10 mg FDE/mL），可能归因于芦丁和绿原酸这两种主要多酚。Vv提取物的抑制活性最低（IC₅₀=7.44±0.13 mg FDE/mL），Oe提取物介于两者之间（IC₅₀=6.42±0.16 mg FDE/mL）。合成抑制剂阿卡波糖的IC₅₀为0.029±0.001 mg/mL，其效率约为所研究提取物的200倍以上。

α-淀粉酶抑制模式：动力学分析显示，三种植物提取物均使表观V_max（约0.22–0.24 mM/min）和表观K_m（约0.61–0.69 mg/mL）同步下降，这是非竞争性抑制的典型特征——抑制剂与酶-底物（ES）复合物结合形成无活性的ESI物种。相比之下，阿卡波糖使表观K_m升高至3.58 mg/mL而V_max不变（0.73 mM/min），符合竞争性抑制模式。

二元和三元组合的α-淀粉酶抑制及组合指数（CI）行为：Ma-Vv组合主要呈现加性至轻度拮抗作用（CI=1.08–1.28）；Ma-Oe组合在所有测试比例下均表现拮抗。Vv-Oe二元组合在所有混合比例下均表现出协同作用（CI=0.16–0.55），最强协同出现在75:25比例（CI=0.16），抑制率达97.77%。三元组合中，增加Vv比例并保持Ma和Oe平衡（25:50:25）增强了抑制效果（抑制率81.77%，CI=0.51，协同）；增加Oe比例（25:25:50）趋向加性（抑制率40.91%，CI=1.18）；而Ma比例较高时（50:25:25）呈现拮抗（抑制率30.81%，CI=1.39）。

四、讨论总结与研究结论

协同作用的出现可能归因于多位点结合这一已确立的协同机制，多酚组合可增强酶抑制效果。Vv和Oe提取物的互补作用机制表明，Vv提取物中的化合物可能增强了Oe提取物中生物活性化合物的效力。拮抗作用则发生于抑制剂竞争同一靶位点时，降低了组合效率。

本研究结论指出，Ma、Vv和Oe三种植物叶提取物均具有抗氧化活性，其中Vv和Oe组合提取物在体外对α-淀粉酶表现出潜在的协同抑制效果，优于其他组合提取物，但其抑制活性仍低于阿卡波糖。这些结果可为开发增强α-淀粉酶抑制活性的功能性食品提供参考。本研究的主要局限性在于缺乏体内数据来佐证所观察到的抗氧化和抗糖尿病活性，体外研究无法完全模拟人体肠道的复杂性和化合物的生物利用度；此外，缺乏分子对接研究限制了对潜在机制性相互作用的理解，这些方面需要在未来研究中加以解决。