阴道制剂选择性抑制惰性乳杆菌与念珠菌属并保护卷曲乳杆菌的研究

《International Microbiology》：Vaginal formulations selectively target Lactobacillus iners and Candida spp. while preserving Lactobacillus crispatus

　　

阴道稳态（vaginal eubiosis）与低细菌多样性及卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）优势相关，而惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）常在抗生素治疗后持续存在。研究人员评估了抑制惰性乳杆菌和念珠菌属（Candida spp.）同时保护卷曲乳杆菌的互补策略。对每种乳杆菌各5株菌株进行的碳水化合物筛选显示选择性不足。油酸（oleic acid）表现出最宽的敏感性差异：对惰性乳杆菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为0.4和0.8 mM，而对卷曲乳杆菌则为1.6至>6.4 mM。24小时后，含0.25%低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins, OPCs）、0.05%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）和6.4 mM油酸的混合物使惰性乳杆菌计数较对照组降低4.8 log10 CFU/mL，使四种念珠菌物种计数降低1.4–2.5 log10 CFU/mL，同时保护了三株卷曲乳杆菌菌株。HeLa细胞毒性在未稀释混合物的25%–100%浓度下增加。纯化的单可林KA（monacolin KA）显示出比单可林K（monacolin K）更广谱的抗真菌活性，在50 μg/mL浓度下使白色念珠菌（C. albicans）计数较溶剂对照组降低4.3 log10，同时维持卷曲乳杆菌的高活力。在一例接受M247补充及其他联合治疗的患者中，一种油基原型制剂与卷曲乳杆菌优势恢复（96.9%；群落状态类型I）呈时间相关性。这些发现支持选择性阴道制剂的开发；临床疗效及有效且细胞相容的暴露剂量仍有待确定。

研究背景与目的

阴道微生态的健康状态（阴道稳态，vaginal eubiosis）通常表现为低细菌多样性和乳杆菌（Lactobacillus）物种的优势定植。其中，卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）主导的群落状态类型I（CST I）被认为是最稳定的阴道微生态类型，其通过产乳酸维持低pH环境，从而抑制病原微生物生长。相比之下，惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）尽管也常见于无症状女性，但其代谢能力有限，常在抗生素治疗后持续存在，并与更高的念珠菌（Candida）定植率、高危型人乳头瘤病毒（HPV）清除率降低、体外受精结局不佳以及自发性早产风险增加等不良临床结局相关联。细菌性阴道病（bacterial vaginosis, BV）经甲硝唑等抗生素治疗后复发率高，且治疗后阴道菌群常转变为惰性乳杆菌主导的状态。因此，促进卷曲乳杆菌优势、抑制惰性乳杆菌和念珠菌的阴道微生态调控策略具有重要的临床意义。本研究旨在通过体外实验和一项探索性临床观察，评估两种互补的局部阴道制剂模块：一是利用油酸（oleic acid）、低聚原花青素（OPCs）和乙二胺四乙酸（EDTA）实现选择性抑制惰性乳杆菌并保护卷曲乳杆菌；二是利用单可林K（monacolin K, MK）及其β-羟基酸形式单可林KA（monacolin KA, MKA）实现抗真菌活性，同时保持与卷曲乳杆菌的相容性。

主要研究方法

研究采用逐步体外筛选流程：1）利用API 50 CH和API ZYM试条对5株卷曲乳杆菌和5株惰性乳杆菌进行碳水化合物代谢和酶学谱分析；2）在无糖MRS基础培养基中测试不同碳水化合物底物对乳杆菌生长的支持作用；3）在模拟阴道液（simulated vaginal fluid, SVF）背景下初步筛选含硼酸、OPCs、EDTA和棉子糖的配方效果；4）通过微量肉汤稀释法测定长链脂肪酸（油酸、亚油酸、棕榈油酸）对乳杆菌和念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌/杀真菌浓度（MBC/MFC）；5）在选定配方（0.25% OPCs + 0.05% EDTA + 6.4 mM油酸）中对惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌和四种念珠菌进行挑战试验；6）通过乳酸脱氢酶（LDH）释放法在HeLa细胞中评估细胞毒性；7）对一例接受辅助生殖治疗的患者的纵向阴道菌群监测数据进行回顾性分析（基于16S rRNA基因V3区测序和16-23S rRNA内部转录间隔区测序）。

研究结果

代谢谱分析与碳水化合物筛选：API 50 CH分析显示，卷曲乳杆菌的碳水化合物利用谱更广且具有菌株依赖性，而所有5株惰性乳杆菌均只能利用葡萄糖和麦芽糖，不能利用半乳糖、木糖或棉子糖。API ZYM检测到所有卷曲乳杆菌均具有亮氨酸芳胺酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性，所有惰性乳杆菌均具有酯酶（C4）、亮氨酸芳胺酶和α-葡萄糖苷酶活性。然而，在营养丰富的培养基中，半乳糖、木糖和棉子糖未能提供足够的种间选择性，因为惰性乳杆菌也能达到与卷曲乳杆菌相当的活菌数。此外，去除马血后，所有惰性乳杆菌均无法检测到复制，提示血液来源的营养物质对其生长至关重要。

改良模拟阴道液的选择性活性：含3%硼酸、0.25% OPCs、0.05% EDTA和0.5%棉子糖的改良模拟阴道液（SVMF）在48小时后使惰性乳杆菌活菌数较基线降低约3 log₁₀ CFU/mL，对大多数卷曲乳杆菌菌株的影响较小（约1 log₁₀ CFU/mL降低）。单独的3%硼酸使惰性乳杆菌降低约2 log₁₀ CFU/mL。

卷曲乳杆菌相容组分与油酸的筛选：在后续实验中，0.25% OPCs与0.05% EDTA的组合对卷曲乳杆菌M247、SS和DC的抑制作用最小，被选用于最终配方。在三种长链脂肪酸中，油酸对惰性乳杆菌和卷曲乳杆菌之间的选择性窗口最大：其对惰性乳杆菌DSM 13335的MIC和MBC分别为0.4和0.8 mM，而对三株卷曲乳杆菌的MIC/MBC范围为1.6至>6.4 mM。亚油酸和棕榈油酸的选择性窗口较窄。

候选配方的抗菌活性与细胞毒性：含0.25% OPCs、0.05% EDTA和6.4 mM油酸的配方在24小时后使惰性乳杆菌活菌数较对照降低约4.8 log₁₀ CFU/mL，而三株卷曲乳杆菌的计数与对照无显著差异（仅降低0.3–0.5 log₁₀ CFU/mL）。该配方对四种念珠菌均产生显著抑制作用：白色念珠菌（C. albicans）降低约2.5 log₁₀，光滑念珠菌（C. glabrata）降低1.8 log₁₀，克柔念珠菌（C. krusei）降低2.4 log₁₀，近平滑念珠菌（C. parapsilosis）降低1.4 log₁₀ CFU/mL。在HeLa细胞中，未稀释配方的1.56%–12.5%浓度未显著增加LDH释放，而25%–100%浓度则引起浓度依赖性的细胞毒性增加。

单可林的抗真菌活性与卷曲乳杆菌相容性：纯化MKA在50 μg/mL浓度下表现出最广谱的抗真菌活性，使白色念珠菌计数较溶剂对照降低4.3 log₁₀ CFU/mL，同时对卷曲乳杆菌的活力影响最小（终点计数7.88–8.35 log₁₀ CFU/mL）。MK在相同浓度下对白色念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌也有活性（降低2.0–2.8 log₁₀），但对克柔念珠菌效果较弱。两种形式的单可林在25–50 μg/mL浓度下均保持了卷曲乳杆菌的高活力。

长链脂肪酸对念珠菌的MIC和MFC：单独测试时，油酸、亚油酸和棕榈油酸对所有四种念珠菌的MIC和MFC均大于6.4 mM，表明单一脂肪酸的浮游杀菌活性有限，配方中的抗真菌效果可能来源于成分间的协同作用。

纵向临床概念验证观察：一名32岁接受辅助生殖治疗的女性患者，初始阴道菌群为CST I（卷曲乳杆菌约95%）。发生症状性BV后，菌群转为CST IV，经甲硝唑治疗后转为CST III（惰性乳杆菌占99.087%）。在口服和阴道补充卷曲乳杆菌M247的基础上，从2024年11月起加用一种含0.25% OPCs和0.05% EDTA的特级初榨橄榄油基质原型制剂（不含单可林），并给予一周硼酸阴道用药。随后观察到卷曲乳杆菌相对丰度逐步增加：2025年1月为5.695%，6月为25.341%，12月为68.338%，至2026年4月达96.862%。惰性乳杆菌在2025年6月和12月未检出，最终评估时仅占0.337%。此时阴道菌群恢复为CST I，加德纳菌（Gardnerella）未检出，患者无症状，治疗终止。未报告治疗相关不良事件。

讨论与结论

研究表明，油酸、OPCs和EDTA组成的配方能够在体外选择性地抑制惰性乳杆菌和念珠菌，同时保护卷曲乳杆菌，其选择性机制可能与卷曲乳杆菌具有油酸水合酶（OhyA）和脂肪酸外排蛋白FarE介导的脂肪酸耐受性有关，而惰性乳杆菌缺乏这些功能。纯化MKA作为直接抑制HMG-CoA还原酶的活性形式，展现出优于MK的广谱抗真菌活性，且与卷曲乳杆菌相容性好，是局部抗真菌制剂的优先候选成分。探索性临床观察虽受限于单一病例和多种干预措施并存，但原型制剂的使用与卷曲乳杆菌优势的恢复呈现时间相关性，为体外发现提供了初步转化证据。研究结论指出，这些发现支持选择性阴道制剂的开发，但其临床疗效及有效且细胞相容的暴露剂量仍有待进一步确定。未来研究方向包括：评估其他碳水化合物辅料的作用、探索OPCs和EDTA的抗真菌机制、建立活性与细胞毒性的重叠浓度范围、以及开发基于标准化乳香黄连木（Pistacia lentiscus）籽油的替代递送体系。