《Frontiers in Bioinformatics》：Computational identification of candidate biomarkers and compounds associated with skeletal muscle insulin sensitivity improvement mediated by physical activity: an integrative multi-omics and computational chemistry study
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背景： 胰岛素抵抗（Insulin Resistance, IR）是多种慢性疾病的共同病理基础。尽管体力活动能够改善骨骼肌胰岛素敏感性（Insulin Sensitivity, IS），但其潜在的分子机制及靶向药物策略仍不清楚。这项假说生成性研究整合了生物信息
背景： 胰岛素抵抗（Insulin Resistance, IR）是多种慢性疾病的共同病理基础。尽管体力活动能够改善骨骼肌胰岛素敏感性（Insulin Sensitivity, IS），但其潜在的分子机制及靶向药物策略仍不清楚。这项假说生成性研究整合了生物信息学与计算化学方法，利用公共数据集开展；所有发现均为计算预测结果，需实验验证。
方法： 利用一个骨骼肌数据集（GSE24215，n = 10），该数据集包含卧床休息诱导的IR及运动逆转的IR，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和差异表达分析识别候选基因。机器学习、基因集富集分析（GSEA）及调控网络构建确定了关键靶点并预测了潜在机制。为解决靶向药物缺乏的问题，研究采用深度学习驱动的药物发现与多尺度结合验证策略，从天然产物及海洋产物数据库中筛选候选化合物。
结果： WNT4是唯一在两个阶段均被重复识别的候选基因，表现出“卧床休息后上调、运动再训练后下调”的双向表达模式。GSEA预测WNT4表达与能量代谢通路（如氧化磷酸化）正相关，并受预测的转录调控网络（以EGR1为核心）及转录后调控网络（hsa-miR-1238-3p/lncRNAs）介导。从超过700,000个筛选化合物中，确定了三个最优候选化合物。分子动力学模拟、结合自由能计算及量子化学分析初步预测了其结合稳定性及电子结构特征。
结论： 本研究提出WNT4可能在骨骼肌IS的动态调控中发挥作用，构建了“内源性补偿–阶段转换”的功能假说。研究建立了一条计算药物发现流程，为WNT4提供了候选化合物库。鉴于样本量有限（n = 10），所有发现均需在独立队列及实验中进一步验证。
一、研究背景与科学问题
胰岛素抵抗（Insulin Resistance, IR）是指胰岛素靶组织对正常水平胰岛素反应能力下降，导致葡萄糖摄取受损和脂质代谢紊乱，是2型糖尿病、代谢综合征及心血管疾病等多种慢性非传染性疾病的关键病理基础。流行病学系统综述显示，成人（≥18岁）IR患病率高达26.53%，构成严重的公共卫生问题。当前临床用于改善IR的干预药物主要包括双胍类、噻唑烷二酮类及GLP-1受体激动剂，但其适用范围有限且存在一定不良反应，临床亟需替代疗法。体力活动等非药物干预策略因其综合获益被作为IR管理的基础方案，其中骨骼肌在运动调节胰岛素敏感性（Insulin Sensitivity, IS）中发挥核心作用——骨骼肌承担餐后口服葡萄糖处置的80%以上，不仅维持葡萄糖稳态，还通过分泌肌因子参与全身IS调节。然而，体力活动调节骨骼肌IS的动态分子机制仍不清楚，限制了靶点筛选及转化应用。为此，本研究选用包含“卧床诱导IR-运动逆转IR”双向干预设计的骨骼肌数据集（GSE24215，n = 10），该数据集允许系统比较不同阶段IS的动态变化，为识别可逆靶点提供了理想材料。
二、研究内容与核心结论
研究人员基于上述双向调控队列，整合加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达基因（DEG）分析及多算法机器学习联合验证等生物信息学策略，系统挖掘与IS相关的可逆关键靶点。针对传统靶点开发周期长、成药性差等瓶颈，构建了以虚拟筛选为中心、整合本地部署AI模型、海洋天然产物数据库、分子动力学模拟及量子化学计算的计算药物发现系统，为候选靶点初步筛选具有优良类药性的候选化合物库。研究最终确定WNT4为唯一在两个阶段均被重复识别的候选基因，其表达在Pre-BR-RE过程中呈现先升后降的双向模式，提示其可能参与骨骼肌IS的动态调控。研究提出WNT4“内源性补偿–阶段转换”功能假说，并建立了从经典力学到量子力学的多尺度级联验证方法框架，为WNT4靶向药物开发提供了候选化合物及可推广的计算方法学路径。所有发现均为计算预测，需在独立队列及实验中进一步验证。
三、主要关键技术方法
本研究基于公共基因表达数据集GSE24215（来自10名受试者的股外侧肌样本，包含基线Pre、9天卧床BR、4周运动再训练RE三个阶段）。主要技术方法包括：WGCNA共表达网络分析与limma配对差异表达分析筛选候选基因集；LASSO回归与随机森林多算法共识筛选候选靶点；留一交叉验证（LOOCV）评估基因诊断效能；基因集富集分析（GSEA）探索相关通路；基于TRRUST、TargetScan、miRNet等数据库构建转录因子-信使RNA-微小RNA-长链非编码RNA调控网络；DrugBank药物-基因互作分析；AlphaFold蛋白结构预测与Uni-STE结合口袋预测；DiffDock深度学习分子对接对超过70万化合物进行虚拟筛选；GROMACS分子动力学模拟（100 ns）；MM-GBSA结合自由能计算；ORCA密度泛函理论（DFT）量子化学计算。
四、研究结果
4.1 疾病靶点发现
4.1.1 候选基因集筛选： 通过WGCNA，在BR vs. Pre阶段（软阈值β=4）识别出23个基因模块，其中黑色模块（r=0.83，P=6.8e-6）与表型显著相关，含319个模块基因；在RE vs. BR阶段（β=5）同样识别23个模块，紫色模块（r=0.74，P=2.1e-4）和红色模块（r=0.73，P=2.2e-4）显著相关，分别含237和417个基因。GEO2R差异分析在BR vs. Pre识别66个DEGs，在RE vs. BR识别46个DEGs。差异模块与DEGs取交集后分别获得46和42个候选基因。
4.1.2 候选基因筛选及诊断效能评估： LASSO与随机森林多算法重叠后，BR vs. Pre阶段确定AQP7、BDH1、GPD2、LOC728978、SDHC、WNT4六个候选靶点；RE vs. BR阶段确定EXTL1、CTGF、FOXM1、IGFBP2、SPRY4、WNT4六个候选靶点。WNT4是唯一在两个阶段均被筛选出的基因。LOOCV-AUC评估显示，WNT4在两个独立比较阶段表现高度一致（BR vs. Pre：0.88，95% CI：0.67–1.00；RE vs. BR：0.87，95% CI：0.66–1.00）。表达差异分析显示WNT4在Pre-BR-RE过程中呈现先升后降的双向表达模式。
4.1.3 基因集富集分析与分子调控网络： GSEA结果显示，与WNT4高表达正相关的通路在两种干预下高度重叠，主要包括心肌收缩、氧化磷酸化和阿尔茨海默病通路；hedgehog信号通路特异关联卧床因素，嘌呤代谢和子宫内膜癌特异关联运动再训练因素。构建的TFs-mRNAs-miRNAs-lncRNAs预测调控网络共获得60条调控轴，筛选出28个潜在环状调控回路，其中EGR1-WNT4-hsa-miR-1238-3p-LINC00969和EGR1-WNT4-hsa-miR-1238-3p-PRKCQ-AS1环状调控回路预测置信度较高（RF≥0.90，SVM≥0.90）。
4.1.4 药物-基因互作分析： DrugBank数据库检索确认目前无直接靶向WNT4的获批治疗药物，表明WNT4靶向药物开发仍属空白领域。
4.2 药物发现
4.2.1 WNT4蛋白结构建模与评估： 从UniProt获取WNT4氨基酸序列（登录号：P56705），AlphaFold预测结构平均pLDDT评分为93.12，预测结合口袋附近（CYS208/GLY210/SER214）的残基pLDDT值分别为92.38、84.44和81.06，PAE矩阵进一步验证了结构域间相对空间位置的合理性。
4.2.2 天然产物与海洋产物配体库构建： 从COCONUT和CMNPD数据库下载超过700,000个化合物，经类药五规则（RO5）和定量类药性估计（QED）初步过滤后，分别获得37,280和47,450个候选化合物。
4.2.3 活性口袋预测与虚拟筛选： 部署Uni-STE预测WNT4潜在结合口袋，使用DiffDock进行深度学习分子对接。5,411个化合物因内部构象生成或模型推理失败被自动跳过，最终79,319个分子成功对接。181个化合物置信度>0被列为高置信候选，5,740个化合物置信度≥?1.5被列为中置信候选。
4.2.4 分子结合模式与相互作用分析： 选取DiffDock置信度排名前三的候选化合物（CMNPD4923、CMNPD27319、CMNPD30941），PLIP分析显示三个分子均稳定结合于WNT4同一活性区域（CYS208、GLY210、SER214附近），主要通过氢键相互作用，键距集中在1.70–2.42 ?。其中CMNPD27319与GLY210和SER214形成多个强氢键，提示其可能具有相对较强的结合潜力。
4.2.5 分子动力学模拟： 对三个复合物进行100 ns全原子MD模拟。50–100 ns期间三个体系均达到平衡，平均RMSD±SD分别为0.6659±0.0480、0.7855±0.0310和0.8639±0.0492 nm。RMSF分析显示高波动残基（>0.3 nm）比例分别为18.5%、22.5%和30.5%。SASA和Rg值波动较小，不支持配体结合诱导蛋白去折叠的可能性。
4.2.6 结合自由能计算： MM-GBSA计算显示三个体系的总结合能（ΔTOTAL）分别为?20.08±2.97、?17.13±1.87和?5.80±3.32 kcal/mol。ΔGGAS是结合的核心驱动力，其中范德华相互作用（ΔVDWAALS）贡献最大；ΔEGB呈现显著正值，构成主要的去溶剂化惩罚。残基能量贡献分析显示GLY210、GLY213、SER214在三个体系中均提供一致的结合能贡献，是维持体系稳定的共同关键位点。CMNPD4923和CMNPD27319的ΔTOTAL显著为负，提示其结合潜力相对较强；CMNPD30941的结合能力相对有限。
4.2.7 密度泛函理论计算： DFT计算显示CMNPD4923、CMNPD27319和CMNPD30941的HOMO-LUMO能隙（ΔE）分别为0.122、0.088和0.182 a.u.。HOMO轨道主要定域于芳香环和亚甲基（-CH-）等富电子区域，LUMO轨道主要分布于羰基（C=O）、亚胺（-NH-）和羟基（-OH）等缺电子区域，提示这些分子具有活跃的电子云分布和潜在电荷转移特征。
五、讨论与结论
讨论部分围绕WNT4的“内源性补偿–阶段转换”假说展开。研究认为，卧床早期WNT4反应性升高可能代表骨骼肌面对机械剥夺时试图稳定线粒体网络、维持内环境稳态的代偿性保护机制——WNT4作为经典Wnt通路抑制剂可阻断WNT3a刺激的细胞生长和胰岛素分泌，且是维持肌肉干细胞静息态的关键因子。然而当卧床应激持续时，WNT4持续高表达导致经典Wnt/β-catenin通路过度抑制，可能加剧肌细胞内脂质沉积并抑制AMPK和IRS-1等关键胰岛素信号节点，从而影响骨骼肌IS。WNT4作为可分泌性肌因子，局部过度蓄积后可进入循环产生全身效应，对胰岛功能构成潜在内分泌威胁。研究还讨论了WNT4靶向药物开发的困境：现有干预策略多为间接方式（如重组蛋白外源补充或腺相关病毒介导的过表达），难以实现精确的时空控制，且WNT4功能具有组织特异性和功能二重性，可能引发不可预测的全身副作用。传统直接靶向Wnt通路的策略也面临脱靶毒性瓶颈。本研究构建的计算药物发现流程从超过70万化合物中筛选出候选化合物，其中CMNPD4923（Damirone B）源自海洋海绵生物碱，CMNPD27319（Aspergilol E）为海洋曲霉属二芳基醚次级代谢产物，CMNPD30941（6,8-二羟基-3,7-二甲基异苯并二氢吡喃-1-酮）为多取代异苯并二氢吡喃-1-酮/异香豆素衍生物，结构多样性提示DiffDock模型具备较广的分子识别能力。
研究结论： 本研究利用“卧床诱导IR-运动再训练逆转IR”的双向模型，整合多组学分析方法，初步确定WNT4为两个阶段共同筛选的唯一候选基因，在Pre-BR-RE过程中呈现先升后降的双向表达模式。基于上述相关性及文献证据，研究人员推测卧床期WNT4上调可能构成内源性代偿保护机制，而其长期维持可能参与病理进展，其功能输出聚焦于氧化磷酸化等能量代谢通路。此外，研究构建了以EGR1和ceRNA网络为核心的预测调控网络，为探索WNT4阶段特异性功能转换的分子机制提供了候选回路。针对WNT4的转化瓶颈，研究建立了深度学习驱动的计算药物发现策略和多尺度级联结合验证策略，从超过70万天然及海洋产物中筛选出一批候选化合物。综上所述，本研究提出了以WNT4为中心的骨骼肌IR动态调控工作假说，并为未来靶向WNT4的药物开发提供了候选化合物和可推广的计算方法学框架。上述所有发现均为计算预测，需在独立队列及实验中进一步验证。
