可诱导性人低密度脂蛋白受体转基因小鼠模型增强慢病毒对小鼠免疫细胞的基因递送

《Frontiers in Immunology》：An inducible human LDLR transgenic mouse model for enhanced lentiviral gene delivery to murine immune cells

基于慢病毒（Lentivirus, LV）的免疫细胞改造是细胞治疗中常用的策略。然而，最常用的水疱性口炎病毒G糖蛋白（Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein, VSV-G）假型化慢病毒，由于缺乏最优的进入受体，难以有效介导对小鼠免疫细胞的基因递送。本研究构建了一种转基因小鼠模型，其携带Cre重组酶可诱导的人低密度脂蛋白受体（human Low Density Lipoprotein Receptor, hLDLR）表达元件，该受体是VSV-G假型慢病毒的天然进入受体。令人意外的是，研究人员发现，仅在激活条件下，Cre重组酶才能在小鼠多种免疫细胞中诱导出高水平的hLDLR表达。通过遗传杂交引入Cre转基因小鼠，或利用Cre mRNA-脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNP）瞬时递送Cre重组酶，均可有效增敏小鼠免疫细胞（尤其是T细胞）对VSV-G假型慢病毒介导的基因递送。该新型转基因小鼠模型为在同基因小鼠模型中研究免疫细胞功能及工程化细胞治疗癌症提供了重要工具。

论文解读：可诱导性hLDLR转基因小鼠模型——突破VSV-G慢病毒对小鼠免疫细胞基因递送瓶颈的新工具

一、研究背景与科学问题

在免疫治疗与基础免疫学研究中，对小鼠免疫细胞（尤其是T细胞）进行高效、稳定的基因操作是阐明新型免疫疗法机制、验证现有疗法在免疫健全小鼠模型中的效应的关键前提。目前常用的基因工程方法包括病毒载体转导、电穿孔及脂质纳米颗粒递送等。其中，慢病毒（Lentivirus, LV）转导因其广泛的适用性和可整合入基因组从而实现稳定表型的特点，成为最广泛使用的基因递送手段。在各类慢病毒中，水疱性口炎病毒G糖蛋白（Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein, VSV-G）假型化慢病毒是研究领域中最常用的一类。然而，VSV-G假型慢病毒对小鼠免疫细胞的转导效率极低，这严重制约了在同基因小鼠模型中进行免疫学相关研究。既往研究已证实，低密度脂蛋白受体（Low Density Lipoprotein Receptor, LDLR）是VSV-G假型慢病毒的主要进入受体，病毒通过与LDLR结合，经由网格蛋白介导的受体介导内吞进入细胞。尽管小鼠与人LDLR具有同源性和功能保守性，且均表达于T细胞，但VSV-G慢病毒转导小鼠T细胞的效率显著低于人T细胞，提示人LDLR（hLDLR）在结合VSV-G及促进病毒基因递送方面可能具有更优效能。因此，如何在同基因小鼠模型中实现VSV-G慢病毒对免疫细胞的高效基因递送，成为亟待解决的技术难题。

二、研究内容与主要结论

针对上述瓶颈，研究人员构建了一种携带Cre重组酶可诱导hLDLR表达元件的转基因小鼠模型。该模型通过将CAG-LSL-hLDLR表达盒定点整合至小鼠Rosa26安全港位点，实现了在特定细胞类型中由Cre重组酶介导的hLDLR条件性表达。研究发现，该转基因小鼠的免疫系统发育正常，且hLDLR的诱导表达具有显著的激活依赖性：初始T细胞几乎不表达hLDLR，而在T细胞受体激活后24小时，hLDLR在T细胞、B细胞、树突状细胞（Dendritic Cell, DC）及巨噬细胞等多种免疫细胞亚群中均被强烈诱导，其中T细胞和DC的诱导率超过90%。进一步的基因递送实验表明，hLDLR的诱导表达显著增强了VSV-G慢病毒与小鼠T细胞的结合能力，并成功实现了报告基因（如BFP）及具有治疗意义的细胞因子（人IL-2）的高效递送与稳定整合。此外，研究人员还开发了基于CD5抗体靶向的Cre mRNA-脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）递送策略，可在体外实现对T细胞特异性的hLDLR诱导，进而高效支持VSV-G慢病毒基因递送，基因递送效率可达约90%。该模型为在同基因小鼠肿瘤模型中开展免疫细胞功能研究和工程化细胞治疗提供了通用且高效的工具平台。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要关键技术方法开展研究：其一，利用C57BL/6N JM8A3胚胎干细胞进行Rosa26位点同源重组打靶，构建CAG-LSL-hLDLR条件性表达转基因小鼠，并经核型分析及多代回交确保品系稳定性；其二，通过遗传杂交策略，将hLDLR纯合小鼠与CMV-Cre或LCK-Cre转基因小鼠交配，获得全身性或T细胞特异性hLDLR诱导表达的F1代小鼠；其三，采用流式细胞术对多种免疫细胞亚群进行免疫表型分析及hLDLR表达检测；其四，利用慢病毒包装与转导体系，评估VSV-G假型慢病毒对hLDLR阳性小鼠免疫细胞的结合、基因递送及基因组整合效率；其五，采用微流控技术制备SM-102-based mRNA-LNP，并通过点击化学将CD5抗体偶联至LNP表面，实现T细胞靶向的Cre mRNA递送。所有动物实验均在费城儿童医院（CHOP）IACUC批准下进行。

四、研究结果

1. 异位hLDLR表达足以促进VSV-G慢病毒对小鼠T细胞的基因递送：研究人员首先利用逆转录病毒在小鼠T细胞中异位表达hLDLR，并通过流式分选获得hLDLR高表达细胞群。结果显示，VSV-G慢病毒能够高效地将报告基因GFP递送至hLDLR高表达的小鼠T细胞，证实异位hLDLR表达是促进VSV-G慢病毒基因递送的充分条件。

2. hLDLR转基因小鼠品系的建立：研究人员将hLDLR基因克隆至Rosa26靶向载体，置于强效CAG合成启动子及LoxP-STOP-LoxP（LSL）元件控制之下。经体外NIH 3T3细胞验证Cre介导的hLDLR诱导有效后，将载体转染至C57BL/6N JM8A3 ES细胞，筛选获得核型正常的1C3克隆，并经囊胚显微注射及多代回交，成功建立可育的hLDLR纯合（hLDLR^fl/fl）及杂合（hLDLR^fl/-）转基因小鼠品系。

3. 免疫细胞激活后Cre诱导的hLDLR表达：将hLDLR^fl/fl小鼠与CMV-Cre或LCK-Cre小鼠杂交后，研究人员发现初始T细胞几乎不表达hLDLR，但经αCD3/CD28抗体激活24小时后，hLDLR在T细胞中显著诱导。进一步对激活的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）分析显示，T细胞、B细胞、DC及巨噬细胞均出现高水平的hLDLR诱导，其中DC和T细胞诱导率超过90%。此外，hLDLR表达具有时间依赖性，在激活后24-72小时达到峰值，72小时后回落。

4. hLDLR诱导增强VSV-G慢病毒对小鼠免疫细胞的基因递送：研究人员证实，hLDLR阳性的激活T细胞表现出显著的VSV-G慢病毒结合能力，而野生型T细胞几乎无结合。以BFP为报告基因的VSV-G慢病毒基因递送实验显示，仅hLDLR转基因小鼠的脾细胞能够实现高效的报告基因表达。PCR检测证实了慢病毒基因组在小鼠T细胞基因组中的稳定整合。体内实验进一步表明，经VSV-G慢病毒基因递送的hLDLR转基因T细胞在过继转移至NSG小鼠后，仍可维持约30%的BFP阳性率，显著高于野生型T细胞。

5. Cre mRNA-LNP作为诱导hLDLR表达的高效替代策略：鉴于遗传杂交耗时较长，研究人员开发了CD5抗体偶联的Cre mRNA-LNP递送体系。在hLDLR^fl/fl脾细胞中，该体系可在24小时内优先在T细胞中诱导hLDLR表达。经Cre mRNA-LNP预处理的纯化T细胞，VSV-G慢病毒基因递送效率可达约90%，且基因递送效率与hLDLR诱导水平高度相关。此外，过继转移实验显示hLDLR诱导未引起明显免疫原性。

五、讨论与结论

本研究所建立的Rosa26-CAG-LSL-hLDLR小鼠模型，通过将hLDLR表达与免疫细胞激活状态紧密偶联，定义了激活后24-72小时这一高效的VSV-G慢病毒基因递送时间窗口。该激活依赖性表达特性虽出乎意料，但为离体基因操作提供了明确的时间窗口。遗传杂交与mRNA-LNP两种hLDLR诱导策略各具优势：遗传方法可实现稳定、可遗传的细胞类型选择性诱导，适合长期研究；mRNA-LNP策略则提供快速、不依赖品系杂交的诱导方案，尤其适用于离体操作，并具备未来体内精准干预的潜力。该模型成功将原本对VSV-G慢病毒耐受的小鼠免疫细胞转化为高效可转导靶标，为在同基因小鼠模型中开展免疫细胞功能研究和工程化细胞癌症治疗提供了通用且高效的工具平台。研究也指出，慢病毒进入后屏障（如逆转录、核输入等）仍可能存在，需后续工程化改造以进一步优化。总体而言，该hLDLR转基因小鼠模型为VSV-G慢病毒介导的小鼠免疫细胞基因操作提供了突破性解决方案，具有重要的转化应用前景。