《Frontiers in Immunology》：A novel double-mAb sandwich ELISA utilizing broad-spectrum neutralizing antibodies as an in vitro alternative to the rabies vaccine NIH potency assay
编辑推荐：
背景：狂犬病仍是一种破坏性人兽共患疾病，其预防措施高度依赖暴露后预防（post-exposure prophylaxis, PEP）。传统上，狂犬病疫苗效力评价依赖于体内（in vivo）国立卫生研究院（National Institutes of Healt
背景：狂犬病仍是一种破坏性人兽共患疾病，其预防措施高度依赖暴露后预防（post-exposure prophylaxis, PEP）。传统上，狂犬病疫苗效力评价依赖于体内（in vivo）国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）小鼠攻毒试验，该方法存在检测周期长、重复性低和动物消耗量大等局限性。开发广谱单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）和替代性体外（in vitro）检测方法对于推进狂犬病预防和改善疫苗质量控制至关重要。
方法：在本研究中，研究人员鉴定并表征了三株具有广谱中和活性的人鼠嵌合单克隆抗体（05-2F10、06-2A12和07-4D8-1C1）。研究人员利用体外（in vitro）假病毒中和试验，评估候选单克隆抗体的高中和能力及对变异株的低敏感性，以筛选用于检测方法开发的最佳抗体配对。基于筛选出的单克隆抗体，研究人员建立了一种双抗体夹心ELISA，用于定量人用狂犬病疫苗中的糖蛋白（glycoprotein, G）抗原含量。
结果：三株嵌合单克隆抗体展现出卓越的体外（in vitro）中和效力和广度。所建立的双抗体夹心ELISA成功定量了人用狂犬病疫苗中的G抗原含量。重要的是，该ELISA定量的抗原含量与传统体内（in vivo）NIH小鼠攻毒试验产生的效力数据之间展现出高度相关性。
结论：综上所述，这些发现为用可靠的体外（in vitro）方法替代传统NIH效力试验提供了坚实的技术框架，完全符合动物福利的3Rs原则。
一、研究背景与问题
狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus, RABV）引起的一种破坏性人兽共患传染病，RABV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）。RABV基因组为约12 kb的单链RNA，编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA聚合酶大蛋白（L）五种结构蛋白。其中，表面锚定的G蛋白是介导病毒进入宿主细胞的唯一病毒包膜组分，也是能诱导病毒中和抗体（virus-neutralizing antibodies, VNAs）的主要保护性抗原，因此是宿主免疫应答和疫苗设计的关键靶点。
由于临床症状一旦出现便无特效治疗手段，及时的暴露后预防（PEP）是唯一可挽救生命的干预措施。标准PEP方案包括伤口清洗、系列狂犬病疫苗接种以及针对II级（免疫功能低下者）和III级暴露的被动免疫制剂——狂犬病免疫球蛋白（rabies immunoglobulin, RIG）的给予。然而，人源RIG（hRIG）和马源RIG（eRIG）的全球实施受到制造成本高昂、供应长期短缺以及批次相关安全风险的制约。为克服这些限制，单克隆抗体（mAbs）因其高特异性、一致性和规模化低成本生产的潜力而成为极具前景的替代方案，如Rabishield、RVC-20/RVC-58抗体组合、SYN023以及华北制药开发的NM57S/NC08组合等均展现出强大的中和能力和动物模型保护效果。
在疫苗质量控制方面，传统上依赖体内（in vivo）NIH小鼠攻毒试验评价狂犬病疫苗效力，该方法存在检测周期长、重复性低和动物消耗量大等明显缺陷。国际共识强调，针对G蛋白天然构象的ELISA是传统NIH试验最有前景的替代方法。然而，中国市场上可用的商业化试剂盒极为有限，且现有国内检测方法常存在毒株兼容性差的问题——无法可靠定量不同疫苗毒株（如PM或CTN-1V）或不同宿主细胞基质中的G蛋白含量。许多方法还依赖针对线性表位的抗体，导致与体内（in vivo）生物学效力的相关性差，尤其在评估热应激或降解疫苗时更为突出。
二、研究目的与意义
为填补上述关键空白，研究人员开发并表征了一组靶向RABV G蛋白天然构象上高度保守中和表位（Site I和Site IIa）的广谱人鼠嵌合单克隆抗体。利用这些抗体各自独特的非竞争性结合特异性和对58株街毒株及5种主要疫苗毒株的卓越中和广度，建立了一种双抗体夹心ELISA。该检测方法克服了毒株特异性偏差，提供了通用性强、稳健性高的检测平台，与传统体内（in vivo）NIH效力试验展现出卓越的相关性（R2 = 0.91），为狂犬病疫苗质量控制提供了符合3Rs原则的可靠替代方案。
三、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：首先，以表达CVS-N2c株G基因的哺乳动物表达质粒免疫BALB/c小鼠，经融合和流式细胞术筛选获得8株阳性杂交瘤克隆，并将可变区移植至人IgG1/kappa恒定区框架，构建人鼠嵌合单克隆抗体。其次，利用基于假病毒的高通量中和试验，系统评估了8株嵌合抗体对58株区域性街毒分离株和5种标准疫苗毒株（aGV、CTN-1V、PV、Flury-LEP和PM）的中和广度与效力。第三，针对RABV G蛋白上已定义的抗原表位（Site I、Site IIa、Site IIb、Site III、Site minor a和Site G5）进行系统定点突变，共构建64个单点突变假病毒，通过中和指纹分析精细定位关键氨基酸残基。第四，将关键接触残基映射至RABV G蛋白三聚体融合前构象的冷冻电镜结构（PDB ID: 7U90）上，以可视化功能性表位的空间排布。最后，建立双抗体夹心ELISA并进行系统方法学验证，包括灵敏度、特异性、精密度、准确度和适用性评估，同时通过50°C热加速降解试验建立体外抗原含量与体内NIH效力之间的相关性分析。
四、研究结果
4.1 mAb筛选与表征
研究人员用表达CVS-N2c株G基因的质粒免疫BALB/c小鼠，经筛选获得8株阳性杂交瘤克隆并构建人鼠嵌合抗体。中和广度与效力评估显示，mAb 06-2A12对所有58株街毒株均具有中和活性，IC50值范围为0.065–303.83 ng/mL（中位IC50：2.43 ng/mL）；mAbs 07-4D8-1C1和05-2F10也表现优异，分别中和48株街毒株（中位IC50分别为0.96 ng/mL和2.18 ng/mL）。对5种主要疫苗毒株的交叉评估中，05-2F10和07-4D8-1C1展现出卓越且均匀的效力，IC50值分别覆盖0.68–5.02 ng/mL和1.52–7.05 ng/mL，06-2A12的IC50为0.16–539 ng/mL。其余候选抗体因广度或效力不足被排除。基于高中和广度和一致效力，05-2F10、06-2A12和07-4D8-1C1被选为建立通用定量检测方法的最佳候选抗体。
4.2 mAb结合关键氨基酸残基的精细定位
通过系统定点突变和中和指纹分析发现：mAb 05-2F10主要靶向抗原位点IIa，核心接触残基为G34、C35和T36，突变G34V、C35W和T36D使其敏感性分别降低143倍、214倍和177倍；mAb 06-2A12靶向抗原位点I，K226和G229是关键结合组分，K226Q和G229E突变分别导致75倍和123倍的敏感性下降；mAb 07-4D8-1C1同样靶向抗原位点IIa，但对残基C35、L38和F41有独特依赖性，C35S、L38Q、L38R和F41S突变导致超过100倍的敏感性降低。将关键接触残基映射至冷冻电镜结构后显示，K226和G229形成暴露的环状区域，而G34、C35、T36、L38和F41聚集在相邻的表面可及的螺旋-转角基序中，这种空间分布解释了这些mAb在双抗体夹心ELISA中表现出的非竞争性结合行为。
4.3 双mAb夹心ELISA的建立
基于广谱中和特征和非竞争性表位特性，研究人员设计了互补抗体矩阵：将mAbs 07-4D8-1C1和06-2A12以等比例混合作为固相捕获（包被）抗体，辣根过氧化物酶偶联的05-2F10（05-2F10-HRP）作为液相检测抗体。尽管07-4D8-1C1（捕获）和05-2F10（检测）均识别抗原位点IIa并共享接触残基C35，但二者精细表位足迹不同，可实现非竞争性结合。同时，在捕获双抗体混合物中引入06-2A12（Site I）可确保抗原高效、无重叠地固定在板上，为05-2F10-HRP检测留出充足的可及位点而无空间位阻。
4.4 双mAb夹心ELISA的方法学验证
方法学验证结果显示：该检测方法的线性范围为0.003125–0.05 IU/mL，检测下限（LLOD）为0.003125 IU/mL，标准曲线方程Y = 64.81X - 0.08275，相关系数R2 = 0.9994。特异性验证中，仅狂犬病疫苗和狂犬病假病毒产生稳健的剂量依赖性阳性信号，而流感疫苗、细胞培养上清和牛血清均呈平坦的基线阴性读数，证明该方法具有高特异性和可忽略的非RABV组分基质干扰。精密度评估中，除第4天低浓度标准品出现16.40%的批内变异系数（CV）外，其余批内CV（4.60%–15.00%）和批间CV（13.80%和14.20%）均保持在15%的可接受标准内。准确度评估中，平均相对偏差在15%以内，单个测量偏差范围为3%–15.2%。适用性验证中，该方法成功定量了来自7个不同制造商的人用狂犬病疫苗中的G蛋白含量，所有制剂均呈现高度均匀、剂量依赖性定量谱，对制造商间疫苗毒株和宿主细胞基质的差异表现出极小的敏感性变化。
4.5 体外抗原含量与体内效力的相关性
研究人员将灭活商业疫苗原液在50°C下进行0、1、2和4小时的热加速降解，诱导渐进性抗原变性。ELISA定量的相对抗原含量随时间线性下降，线性回归分析得出降解斜率为-0.2735（Y截距=0.843，R2 = 0.81），代表50°C下每小时平均损失基线效力的27.13%。平行进行的经典体内（in vivo）NIH小鼠效力试验显示，小鼠死亡率呈现清晰的剂量依赖和热处理依赖模式。将log转化的体外ELISA抗原回收率与体内NIH效力值进行线性回归分析，获得高相关系数（R2 = 0.91）。体内保护数据与血清抗体滴度也高度相关（R2 = 0.72）。这些数据验证了双mAb夹心ELISA可作为疫苗稳定性和效力的高灵敏度替代指标。
五、讨论与结论
全球每年有超过1500万人接受狂犬病PEP，但高危III级暴露患者中接受必要RIG治疗者不足10%。这一关键治疗缺口主要由血液来源免疫球蛋白的制造成本高昂、全球供应严重短缺以及血清衍生物批次间差异的固有风险驱动。目前替代血液来源RIG的最可行策略是开发重组单克隆抗体组合，监管框架要求此类组合至少包含两株靶向G蛋白高度保守表位的非竞争性mAb，以最大限度降低不同地理区域街毒株间中和逃逸的风险。
本研究中，mAb 06-2A12单独即可中和58株区域性街毒分离株，表位定位确定其靶向抗原位点I，K226和G229为关键接触残基。基于Wang等人对2890株流行街毒株的序列比对数据，K226和G229位点高度保守，多态性稳定率分别为99.96%和100%。相比之下，05-2F10和07-4D8-1C1靶向抗原位点IIa内的不同补丁，G34、C35、T36为05-2F10结合所必需，而C35、L38、F41锚定07-4D8-1C1。这些位点在2890株街毒株中的保守率分别为99.90%（G34）、99.97%（C35）、83.22%（T36）、100%（L38）和99.72%（F41）。尽管T36保守率较低，但表位定位表明结合主要由G34–C35核心基序稳定，不过评估源自罕见T36变异分离株的疫苗时需考虑潜在的结合变异。
将体外检测方法转化为官方监管采用需遵循WHO建议（TRS No. 941、No. 1012）等国际标准。单实验室验证仅提供必要概念验证，正式监管互换性需通过独立实验室间的多中心协作研究并使用WHO参考标准品确认实验室间重复性。实施该检测方法可带来显著的3R效益：标准NIH试验每批次消耗100–160只小鼠，在中国等主要生产国全国采用该高通量ELISA预计每年可节省50,000至80,000只小鼠，同时将检测时间从数周缩短至数小时并消除动物痛苦。
本研究存在以下局限性：第一，检测方法的定量准确性高度依赖两个特定中和表位（Site I和Site IIa）的结构完整性和保守性，非标准或新出现疫苗毒株中这些表位的天然抗原变异或氨基酸替换可能改变mAb结合亲和力，导致天然G蛋白定量偏低或偏高。第二，研究主要集中于原液和无佐剂疫苗制剂，需进一步评估佐剂成品中的基质干扰或抗原回收效率。第三，体外G蛋白含量与小鼠攻毒保护相关性良好，但ELISA效力指标如何直接转化为WHO推荐的人体或动物模型免疫原性阈值仍存在不确定性。第四，将该候选ELISA从有前景的过程监控工具转变为国际认可的批次放行方法，需利用WHO认可的国际参考标准品进行全面的多中心交叉验证研究。
值得注意的是，位置T36（在2890株街毒株中保守率为83.22%）是唯一检测抗体（05-2F10）的核心接触残基。天然存在的T36变异虽然可能保留G蛋白结构完整性和生物学功能，但在该ELISA系统中可能表现出降低的检测灵敏度。为降低生物安全风险并防止天然野外分离株潜在的检测逃逸，建议采用该检测方法的监管框架将含T36变异（如T36S、T36D及新报告的临床多态性）的假病毒常规检测作为标准质量控制方案的必要组成部分。
虽然当前相关性足以支持过程抗原监控和放行检测，但正式建立监管批次放行等效性仍需进一步国际多中心协作研究和扩大批次评估。此外，本研究虽确定了检测下限（LLOD），但正式定量下限（LLOQ）和全面稳健性评估尚未系统完成。铝佐剂制剂中抗原吸附状态对表位可及性的潜在影响也需在后续研究中进行针对性方法学评估和优化。符合3Rs原则，该体外检测方法专门监测热应激下的表位完整性，作为补充工具而非总抗原量或总体效力的直接替代指标。
综上所述，本研究开发的双mAb夹心ELISA成功定量了人用狂犬病疫苗中的G抗原含量，与传统体内（in vivo）NIH效力试验展现出高度相关性（R2 = 0.91），为用可靠的体外（in vitro）方法替代传统NIH效力试验提供了坚实的技术框架，完全符合动物福利的3Rs原则。
