《Frontiers in Genome Editing》：Variable alterations in frequencies of CRISPR/Cas9-induced nucleotide deletion and insertion in transgenic maize callus tissues exposed to chromatin modifiers
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鉴于植物基因组编辑中CRISPR/Cas9高效应用的需求日益增长，亟需能够提升靶向诱变效率的方法学。本研究利用稳定转基因玉米愈伤组织，其携带分别靶向异常细胞分裂素应答1基因（abnormal cytokinin response 1, ARE1）或钾通道基因（
鉴于植物基因组编辑中CRISPR/Cas9高效应用的需求日益增长，亟需能够提升靶向诱变效率的方法学。本研究利用稳定转基因玉米愈伤组织，其携带分别靶向异常细胞分裂素应答1基因（abnormal cytokinin response 1, ARE1）或钾通道基因（potassium channel, KAT2）的活性CRISPR/Cas9载体系统。所呈现的DNA测序数据表明，采用3′端截短导向RNA（guide RNA）的KAT2靶向载体仍保留诱变活性，尽管频率极低。研究人员量化了经高温（37?°C处理48小时）及多种染色质修饰化合物（包括丁酸钠（sodium butyrate, NaBt）、烟酰胺（nicotinamide, NA）和5-氮杂胞苷（5-azacytidine, AZA））处理后诱变事件的发生情况。单独高温处理使ARE1靶基因中核苷酸删除频率增加（相较于未处理样品提高5.8倍）。相反，在KAT2基因中，删除和插入均被刺激（分别提高6.4倍和6.2倍）。作为一项创新方法，研究人员评估了染色质修饰化合物与热处理联合施用的诱变效果。NaBt和AZA与高温的联合应用在提高插入频率方面尤为有效；在ARE1基因中（NaBt+热处理：提高17.3倍），在KAT2基因中（AZA+热处理：提高21.4倍）。对悬浮培养细胞的细胞周期分析显示，染色质修饰处理改变了细胞周期进程，表现为G2期细胞积累以及有丝分裂细胞数量显著减少。后续DNA测序证实，删除和插入的诱导呈差异性增加，同时删除区域有所扩展。
研究背景与科学问题
在植物科学研究领域，CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术虽已获得广泛应用，但仍面临靶向诱变效率低下的瓶颈问题。突变频率不仅取决于Cas9蛋白的活性，还受受体植物细胞染色质结构的影响。松弛的染色质构象有利于Cas9结合及随后的DNA修复途径，从而提升编辑效率。Cas9核酸内切酶通过其两个核酸酶结构域（RuvC和HNH）诱导DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs），这些断裂可通过经典非同源末端连接（canonical non-homologous end joining, cNHEJ）、微同源介导的末端连接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）或同源重组（homologous recombination, HR）等内源性修复途径进行修复。在此过程中，可能产生插入和缺失（insertions and deletions, indels），从而破坏靶位点的基因结构。此外，染色质可及性、DNA甲基化和组蛋白修饰显著影响Cas蛋白的结合与编辑效率，异染色质（浓缩）区域对Cas9-gRNA复合体的可及性较低。因此，探索通过调控染色质状态来提升CRISPR/Cas9编辑效率的新策略具有重要的科学意义和应用价值。
研究内容与主要发现
本研究中，研究人员利用稳定转化的玉米愈伤组织，该系统携带靶向ARE1基因（全长导向RNA）或KAT2基因（3′端截短导向RNA）的功能性CRISPR/Cas9载体，旨在分析高温、染色质修饰化合物及其联合处理对诱变事件频率的影响。研究得出以下主要结论：首先，高温（37?°C处理48小时）单独处理可显著提升诱变频率，尤其在ARE1基因中优先促进核苷酸删除（提高5.84倍），而在KAT2基因中则同等程度地刺激删除和插入（分别提高6.4倍和6.2倍）。其次，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（NaBt）单独处理在ARE1基因中显著提升插入频率（约19.5倍），而另一抑制剂烟酰胺（NA）则主要增加删除频率（3.26倍）。第三，DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（AZA）单独处理对ARE1基因的诱变效应有限，但在与热联合后显著提升插入事件。最为重要的是，联合处理展现出显著的叠加效应：NaBt与热联合在ARE1基因中使总诱变频率达到46.11%，其中插入频率提升17.3倍；AZA与热联合在KAT2基因中使插入频率提升21.4倍。此外，联合处理还导致删除片段的长度显著增加，提示微同源介导的末端连接（MMEJ）修复途径可能参与其中。细胞周期分析揭示，所有处理组合均导致G2期细胞积累和有丝分裂细胞数量减少，表明染色质修饰处理通过改变细胞周期进程来影响DNA修复途径的选择，进而影响突变谱系。
关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：利用农杆菌介导法转化玉米愈伤组织（SZ17品系，由匈牙利塞格德谷物研究所提供），获得稳定表达CRISPR/Cas9系统的转基因细胞系；通过流式细胞术分析悬浮培养细胞的细胞周期分布；借助共聚焦激光扫描显微镜观察并计数有丝分裂细胞；采用二代测序（next-generation sequencing, NGS）技术检测CRISPR/Cas9特异性编辑事件，并通过生物信息学分析量化突变频率。
研究结果详述
3.1 用于突变频率量化的测试愈伤组织特征：研究人员确认了两个测试细胞系中CRISPR/Cas9载体关键基因的整合。值得注意的是，KAT2基因靶向载体因紧邻PAM上游的一个腺嘌呤（A）核苷酸缺失而导致gRNA 3′端截短，其在标准培养条件下（24?°C）的突变频率比ARE1基因低约100倍，表明该截短虽保留了部分功能但效率大幅降低。
3.2 高温、NaBt及其联合处理对诱变效率的修饰作用：高温处理（37?°C，48小时）使ARE1基因删除频率提高5.84倍，插入频率仅提高1.96倍；而KAT2基因中删除和插入均提高约6倍。NaBt单独处理在ARE1基因中使插入频率提高近19.5倍，但删除仅轻微增加。联合处理在ARE1基因中产生中等程度的叠加效应，而在基础编辑效率低的KAT2基因中则表现出显著增强（删除提高6.1倍，插入提高23.09倍），并伴随删除片段长度的增加。
3.3 NA及其与热联合处理的差异效应：NA单独处理使ARE1基因删除频率提高3.26倍，并产生5-10个核苷酸的大片段删除。在KAT2基因中，NA处理使删除频率提高19.4倍，但删除片段长度减小。联合处理优先提升插入频率。与NaBt相比，NA单独处理更倾向于增加删除而非插入。
3.4 AZA及其与热联合处理对诱变的影响：AZA单独处理对ARE1基因诱变效应有限，但联合处理显著提升了插入频率。在KAT2基因中，AZA单独处理使删除频率提高2.2倍，而联合处理使删除和插入分别提高5.8倍和21.36倍。联合处理还导致ARE1基因中出现8-10个核苷酸的较大片段删除。
3.5 染色质修饰化合物及热处理改变细胞周期相分布：对照细胞中约65%处于G0/G1期。热胁迫导致S期和G2期细胞积累，G0/G1期显著减少。化学调节剂与热的联合处理（尤其是H+NaBt）显著降低了有丝分裂指数，并使G2期细胞比例增至约30%，这与联合处理下最高的诱变频率相对应。
总结与讨论
本研究表明，基于携带CRISPR/Cas9载体的转基因玉米愈伤组织测试系统，通过长期培养（15个月）可稳定产生核苷酸删除和插入。高温处理（37?°C，48小时）优先增加ARE1基因的删除频率，而对KAT2基因则同等程度地促进删除和插入。三种染色质修饰化合物单独处理的效果通常弱于热处理或联合处理。联合处理在所有情况下均比单一处理更有效地增加插入事件，其中NaBt与热联合对ARE1基因、NA与热联合对KAT2基因产生了实验中观察到的最高诱变频率。对于KAT2基因，所有联合处理在提高插入缺失百分比方面均优于单一处理。研究人员推测，高温下Cas9核酸酶的最适功能、染色质结构的改变、Cas9切割方式（平末端或交错切口）、CRISPR后修复途径的平衡以及微同源介导的末端连接（MMEJ）途径的可能参与，共同导致了诱变反应的增强。细胞周期分析显示所有处理组合均减少了有丝分裂细胞比例，增加了S期和G2期细胞数量，这为理解诱变机制提供了线索。最终，研究人员得出结论：一种结合热处理与染色质修饰化合物的新方法可用于改善植物细胞中的基因编辑效率。同时，研究人员也指出了研究的局限性，包括测试系统基于去分化的愈伤组织细胞、样本池化导致无法进行生物学重复的统计分析、IGV工作流程仅报告主要变异体而非完整的尺寸-频率分布，以及本研究仅限于两个玉米基因。
