《Frontiers in Insect Science》：Cumulative adult production and aerobic culture-dependent recovery of gut-associated bacteria in Galleria mellonella maintained on polymer-containing diets
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摘要：对能够在合成聚合物存在下发育的昆虫日益增长的兴趣，为研究宿主反应与可培养肠道微生物创造了新的机遇。本研究评估了在对照饮食或含聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚苯乙烯（PS）或聚乙烯（PE）的饮食条件下饲养的蜡螟（Galleria mellonella）的
摘要：对能够在合成聚合物存在下发育的昆虫日益增长的兴趣，为研究宿主反应与可培养肠道微生物创造了新的机遇。本研究评估了在对照饮食或含聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚苯乙烯（PS）或聚乙烯（PE）的饮食条件下饲养的蜡螟（Galleria mellonella）的累计成虫产量，以及从幼虫肠道中回收细菌的情况。研究设立了四种饮食处理——对照组、PET组、PS组和PE组，每组包含5个重复，每个重复初始有15只幼虫。每个实验群体持续接受其指定饮食，直至初始群体完成生命周期并产生第二代。从这一子代群体中选择幼虫用于细菌分离，其余个体继续发育以测量累计成虫产量。通过测序16S rRNA基因的V4区并使用BLASTn进行比较，随后进行属级分类学鉴定，对分离株进行了表征。第二代累计成虫产量在不同处理间存在差异（P = 0.0194）。对照组的平均成虫数量最高（122.0 ± 56.3），而PET组最低（41.8 ± 19.1），并且是唯一显著低于对照组的处理。研究人员选取了14个代表视觉上不同菌落形态型的细菌分离株进行表征；这些分离株并不假定代表14个不同的分类单元或菌株。其中13个被鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus），1个被鉴定为嗜冷芽孢杆菌属（Psychrobacillus）。总体而言，所评估的饮食配方与累计成虫产量的变异相关，并为后续的生物勘探研究提供了一个初始的可培养肠道相关细菌菌株库。
1. 研究背景与问题提出
塑料废弃物积累已成为全球重大环境问题，因其合成聚合物产量持续增加、材料在环境中持久存在以及传统废物管理系统效率有限。除了物理、化学和机械管理策略外，塑料生物降解作为一种补充方法日益受到关注，特别是因为某些微生物和酶能在特定条件下转化不同聚合物。在此背景下，几种昆虫物种及其相关微生物群作为研究聚合底物、宿主生理和具有潜在生物技术应用价值的肠道微生物之间相互作用的生物模型引起了兴趣。
蜡螟（Galleria mellonella），俗称大蜡螟，天然与蜜蜂蜂巢和蜂脾相关联。它已被广泛用作生理学、免疫学、毒理学以及宿主-微生物相互作用研究的模式生物。其对合成聚合物的兴趣源于有关幼虫摄入并碎裂聚乙烯及其他聚合物，以及可能发生化学转化或生物降解的报道。然而，对这些现象的解释需要在消耗、碎裂、化学转化和实验证实的降解之间进行仔细区分。
在蜡螟中，聚乙烯（PE）和聚苯乙烯（PS）是研究最广泛的聚合物。已有文献记录了幼虫对这些材料的摄入和碎裂，以及聚合物变化、对昆虫性能的影响和肠道细菌群落的改变。基于测序的研究也描述了在高密度聚乙烯（HDPE）、低密度聚乙烯（LDPE）、PS或聚氯乙烯（PVC）饮食下幼虫肠道细菌群落的变化。尽管已从暴露于LDPE的幼虫中回收了活菌，但对不同聚合物饮食下的微生物比较主要依赖于基于DNA的群落谱系分析。依赖培养的分离方法仍然有价值，因为它能提供可直接保存并在功能测定中评估的活微生物。与PE和PS相比，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）在蜡螟研究中受到的关注要少得多。因此，关于蜡螟在涉及PET、PS和PE的饮食条件下的种群水平表现和可培养细菌的信息仍然有限。
针对上述背景，本研究旨在描述在对照饮食或含有PET、PS或PE的饮食条件下饲养的蜡螟的累计成虫产量，并在好氧培养条件下回收可培养的肠道相关细菌。该研究提供了四种饮食配方下种群水平表现的初步比较，以及一个可用于后续功能评估的活菌株库。这两个部分是并行考察的，并不构成因果关系或聚合物生物降解的证据。
2. 主要关键技术方法
研究人员从墨西哥一家商业供应商获得一批蜡螟幼虫，在实验室适应后，选取300只体型相近的活跃幼虫。设立四种饮食处理：商业饲料对照组，以及分别含有PET、PS或PE的三种聚合物饮食处理。每种处理包含5个独立实验单元，每单元15只幼虫。饮食配方按体积比配制，聚合物占80%，商业饲料占20%（对照组为100%商业饲料）。初始群体完成生命周期并产生第二代后，从每单元中选取一只体重200-300 mg的第二代幼虫，将同一处理的5只幼虫肠道组织合并为一个复合样本。采用五种培养基【赖氨酸铁琼脂（LIA）、三糖铁琼脂（TSI）、酵母提取物补充细菌琼脂（YE）、麦康凯琼脂（MAC）和脑心浸液琼脂（BHI）】在35℃好氧条件下进行细菌培养。选取视觉上不同的菌落形态型进行纯化。提取基因组DNA，扩增16S rRNA基因V4区并进行双向Sanger测序，通过BLASTn比对进行属级分类学鉴定。累计成虫产量定义为每实验单元监测结束时计数的第二代成虫总数，采用单因素方差分析（ANOVA）评估饮食效应，并使用Tukey HSD事后检验进行多重比较。
3. 研究结果
3.1 培养基筛选
在接种10-2稀释液100 μL后，定性记录可见菌落的有无。在96小时好氧培养期间，所有复合样本在LIA和MAC上均未检测到生长。TSI在48小时时在对照组和PS样本中出现可见生长，而YE和BHI在所有四种处理中均在24小时内出现可见生长。基于此，选择TSI、YE和BHI用于细菌分离。
3.2 菌落回收与分离株选择
共选择了14个代表视觉上不同菌落形态型的分离株进行进一步表征。其中6个来自对照组复合样本，4个来自PS，2个来自PE，2个来自PET。对照组和PS的分离株从YE、BHI和TSI上回收，而PE和PET的分离株仅从YE和BHI上回收。
3.3 16S rRNA基因V4区测序与属级分类学鉴定
所有14个分离株的16S rRNA基因V4区扩增产物约300 bp，经组装和去除引物及低质量末端区域后，最终一致序列长度为244-253 bp。BLASTn搜索支持属级分类学分配。13个分离株被分配到芽孢杆菌属（Bacillus），而PET14被分配到嗜冷芽孢杆菌属（Psychrobacillus）。芽孢杆菌分离株从所有四种饮食处理中回收：对照组6个，PS组4个，PE组2个，PET组1个。
3.4 含聚合物饮食下的累计成虫产量
第二代累计成虫产量的平均值±标准差分别为：对照组122.0 ± 56.3，PS组60.4 ± 26.2，PE组64.0 ± 35.4，PET组41.8 ± 19.1。单因素方差分析显示饮食处理间存在整体差异（F(3, 16) = 4.402, P = 0.0194）。Tukey HSD事后检验表明，PET组的平均值显著低于对照组（P = 0.0163），而PS和PE组与对照组无显著差异（P值分别为0.0767和0.1016）。
4. 讨论总结
研究结果显示了一个清晰的模式：对照组的累计成虫产量最高，PET组平均值最低且是与对照组相比唯一具有统计学显著差异的处理，PS和PE组则表现出数值上的降低。同时，研究人员在所有四种饮食条件下获得了14个可培养细菌分离株，主要为芽孢杆菌属。这两部分结果应被视为平行发现，而非成虫产量与回收细菌之间存在直接关系的证据。
累计成虫产量提供了一个整合的群体性能指标，因为它反映了初始群体的繁殖以及第二代的发育和羽化。PET组的较低平均值表明，在所评估的条件下，该配方不如对照组有利于维持第二代成虫产量。饮食成分是解读这一模式的核心。在含聚合物处理中，PET、PS或PE按体积替换了80%的商业饲料，而对照组则完全接受商业饲料。由于累计饲料摄入量未被量化，无法区分营养可用性和聚合物暴露各自的贡献。因此，观察到的差异应归因于完整的饮食配方，而非特指PET、PS或PE的毒性或代谢。
细菌回收也显示出培养基依赖性模式。YE和BHI在所有四种处理中都产生了分离株，而TSI仅在对照组和PS样本中产生分离株。芽孢杆菌属的优势地位与对暴露于塑料材料的昆虫进行的研究中经常出现厚壁菌门成员的现象一致。从PET样本中回收的唯一一株嗜冷芽孢杆菌属分离株扩大了可培养菌株库的分类学范围，但其与PET的特异性关联因缺乏独立的微生物学重复而无法确立。
总体而言，研究结果表明所评估的饮食配方与累计成虫产量的差异相关，并且幼虫是所用条件下可培养细菌的来源。未来结合营养相当的对照、定量摄食测量和阶段特异性监测的研究将有助于更精确地解读种群水平响应。同时，独立的微生物学重复、额外的培养条件、更高分辨率的分类学鉴定和功能测定将需要确定这些分离株的潜在生物技术相关性。本研究因此为进一步研究提供了实验基础，而不假设两组发现之间存在关系或证明了PET、PS或PE的生物降解。
5. 研究结论翻译
本研究表明，所评估的饮食配方与蜡螟（G. mellonella）的累计成虫产量差异相关，并且在所有四种饮食条件下均可回收可培养的肠道相关细菌。PET处理产生的累计成虫产量最低，并且是唯一与对照组存在显著差异的处理，这表明在所测试的条件下，这种饮食配方不太适合维持群体性能。尽管PS和PE也产生了数值上的降低，但这些差异不具有统计学显著性。这些发现描述了对完整饮食配方的响应，并不能区分较低商业饲料比例与聚合物暴露各自的贡献。可培养菌株库包括14个细菌分离株，其中13个被分配到芽孢杆菌属（Bacillus），1个被分配到嗜冷芽孢杆菌属（Psychrobacillus）。这些活菌株构成了一个探索性培养物库，可优先用于未来涉及PET、PS和PE的功能评估。它们的回收不应被解释为处理间细菌组成差异或聚合物生物降解的证据。
