《Biotechnology and Bioengineering》：Cryo-EM Analysis of Adenovirus Vector Reveals Purification Conditions Leading to Loss of Viral Fiber Proteins and Reduced Infectivity
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疫苗和基因治疗需要将遗传物质高效递送至宿主细胞。病毒载体利用病毒进入宿主细胞的能力来实现这一目标。随着利用腺病毒载体的SARS-CoV-2疫苗和新型基因疗法的问世，对载体大规模生产的需求日益增加。腺病毒载体的一个优势在于，它们可以作为未来任何新发疾病的“即插即
疫苗和基因治疗需要将遗传物质高效递送至宿主细胞。病毒载体利用病毒进入宿主细胞的能力来实现这一目标。随着利用腺病毒载体的SARS-CoV-2疫苗和新型基因疗法的问世，对载体大规模生产的需求日益增加。腺病毒载体的一个优势在于，它们可以作为未来任何新发疾病的“即插即用”工具用于疫苗开发。一个关键障碍是最终产品中存在的异质性。这种异质性会降低载体的功能并影响免疫应答。异质性可能的来源之一是下游加工过程，特别是阴离子交换色谱（AEX）的结合和洗脱步骤，该技术被广泛用于大规模生产。为了更好地理解AEX可能对腺病毒衣壳引发的异质性，研究人员采用低温电子断层扫描（cryo-ET）评估了多种色谱条件对衣壳完整性的影响，并与氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心纯化的对照样品进行了比较。为研究色谱过程中的吸附时间效应，研究人员评估了5、10和20分钟柱上吸附期的AEX条件。在pH 6.5条件下进行AEX结合后，样品的感染性颗粒比例从CsCl纯化对照中的17%降至10%。通过电子显微镜检查，病毒粒子出现聚集，纤维占用率从70%降至54%。在pH 6.5条件下进行20分钟AEX保持后，感染性几乎完全丧失，纤维占用率从约70%降至30%以下。在pH 8条件下运行的样品在结合保持20分钟时未表现出相同的感染性丧失。这表明纯化条件可导致纤维蛋白的去除，这可能是导致感染性下降的原因，因为纤维蛋白在细胞进入过程中发挥作用。研究人员推测，纤维蛋白的去除是由保持时间以及AEX过程中常用的低pH条件导致纤维蛋白与五邻体基底之间结合减弱共同引起的。这项工作证明了纤维蛋白丢失与腺病毒载体功能降低之间的联系，以及纯化条件如何影响载体功能。通过研究结构与功能之间的关系，研究人员有望通过优化加工条件来最大限度地减少纯化过程中的感染性损失，降低制造成本，并提高腺病毒疫苗和基因疗法的质量。
论文解读
一、研究背景与目的
病毒载体（Viral Vectors, VVs）利用病毒固有的细胞进入和基因递送能力，在疫苗开发和基因治疗领域具有广泛应用。腺病毒（Adenovirus）是使用最广泛的病毒载体之一，其非包膜双链DNA病毒特性及二十面体衣壳结构（由六邻体Hexon、五邻体Penton及附着于其上的纤维蛋白Fiber构成）使其成为理想的基因递送工具。然而，腺病毒载体生产过程中的一个关键挑战是最终产品的异质性，这种异质性包含感染性颗粒、空衣壳、受损衣壳和未成熟衣壳的混合物，会降低载体功能并可能引发不良免疫反应。
阴离子交换色谱（Anion Exchange Chromatography, AEX）是大规模纯化腺病毒载体的常用方法，但已有研究表明AEX纯化后会出现感染性丧失。由于AEX基于电荷分离，无法区分感染性与非感染性颗粒，且已有证据表明AEX纯化后存在感染性下降的现象，而衣壳仍然完整且含有DNA，因此感染性丧失必然与其他因素有关，如衣壳表面纤维蛋白的丢失。纤维蛋白在腺病毒细胞进入过程中发挥关键作用，其与细胞表面的柯萨奇病毒和腺病毒受体（Coxsackievirus and Adenovirus Receptor, CAR）相互作用，介导病毒附着和进入。
氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心虽可在实验室规模有效分离空衣壳和完整衣壳，但无法规模化放大。因此，理解AEX诱导异质性的根本原因对于优化大规模生产工艺至关重要。此外，当AEX柱加载至最大容量以提高生产率时，载体在膜上的停留时间增加，这已被证明会影响腺相关病毒（AAV）、腺病毒和慢病毒载体。本研究旨在通过低温电子显微镜（Cryo-EM）技术，系统评估不同AEX纯化条件对腺病毒5型（Ad5）衣壳结构的影响，揭示纤维蛋白丢失与感染性降低之间的关联，为优化腺病毒载体生产工艺提供结构生物学依据。
二、研究设计与方法概述
研究人员采用复制缺陷型人腺病毒C5（Ad5），该病毒含有1-β-半乳糖苷酶基因插入片段。病毒在HEK293细胞中扩增后，首先通过两轮CsCl密度梯度超速离心纯化获得高密度带（完整衣壳），作为后续AEX实验的起始材料和对照样品。随后，研究人员设计了多种AEX条件：标准结合条件（AEX Bind Standard）、5分钟保持（AEX Bind 5 min Hold）、10分钟保持（AEX Bind 10 min Hold）和20分钟保持（AEX Bind 20 min Hold），所有结合缓冲液pH为6.5；此外还设置了pH 8条件下的标准结合和20分钟保持条件，以及非结合对照（No Bind Control）以排除色谱系统流动造成的损伤。每个条件设置三个生物学重复。
关键技术方法包括：感染性测定采用抗六邻体免疫染色法（Hexon immunostaining）结合定量PCR（qPCR）计算感染性颗粒百分比；动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）用于检测颗粒聚集状态；低温电子断层扫描（Cryo-Electron Tomography, cryo-ET）用于对单个病毒衣壳进行三维成像，通过倾斜系列采集（-45°至45°，3°增量，总电子剂量100 e?/?2）重建断层图像，并定量分析200个衣壳/条件的纤维占用率（fiber occupancy）。单颗粒分析（Single Particle Analysis, SPA）用于衣壳结构重建，结合AlphaFold3预测的纤维模型构建完整衣壳复合结构。
三、主要研究结果
3.1 CsCl超速离心和AEX纯化导致不同比例的感染性颗粒
通过qPCR和六邻体免疫染色测定，CsCl对照样品平均含有17.1%（±2.5%）感染性颗粒。非结合对照平均为16%（±1.9%），与CsCl对照无显著差异（p=0.65），表明单纯流经色谱系统不造成感染性损失。然而，AEX标准结合（pH 6.5）样品的感染性颗粒显著降至10%（±1.2%）（p<0.02）。添加保持步骤后感染性进一步丧失：5分钟保持后为5%（±0.8%），10分钟保持后为2%（±0.9%），20分钟保持后仅剩0.16%（±0.18%），与CsCl对照相比差异显著（p<0.003）。色谱图显示，保持时间越长，洗脱峰出现越晚且峰高降低，表明延长膜上结合时间增强了多点结合强度。
3.2 pH对AEX后样品的影响
当AEX结合缓冲液pH升至8时，标准结合样品未出现显著的感染性下降。在pH 8条件下20分钟保持后，样品仍保留10.7%（±2.5%）的感染性颗粒，虽然仍显著低于CsCl对照（p<0.02），但与pH 6.5条件下20分钟保持后不足1%的感染性形成鲜明对比。pH 8条件下的洗脱峰出现更早、电导率更低，表明膜结合减弱。这一结果表明，低pH与延长保持时间的组合效应是导致感染性严重丧失的关键因素。
3.3 Cryo-EM研究揭示AEX诱导的纤维丢失
低温电镜成像显示，CsCl对照和非结合对照样品中衣壳在网格上均匀分布，而AEX标准结合和20分钟保持样品出现聚集现象（rafts of aggregate），动态光散射进一步证实了AEX结合条件下衣壳聚集的存在。所有样品中均观察到破损衣壳，可能源于冻融过程，但20分钟保持样品中受损衣壳比例更高。
通过cryo-ET对每个条件200个衣壳进行纤维占用率定量分析，CsCl对照的纤维占用率为70.6%（±9.3%），非结合对照为71.4%（±9%），两者无显著差异，表明色谱流动本身不导致纤维丢失。AEX标准结合样品的纤维占用率降至54%（±10.1%），AEX 20分钟保持样品进一步降至25.7%（±14.3%），两者均与CsCl对照存在极显著差异（Dunnett检验p<0.0001）。纤维占用率与感染性颗粒百分比呈正相关趋势，但20分钟保持样品的感染性下降幅度大于纤维占用率下降幅度，这可能与衣壳聚集有关——聚集颗粒无法被cryo-ET定量分析，可能导致数据偏向于损伤较轻的单个颗粒。
四、讨论与结论
研究人员提出，纤维丢失与感染性降低的关联表明纤维蛋白对Ad5细胞进入至关重要。纤维蛋白通过其N端尾部与五邻体基底相互作用，包括疏水相互作用、氢键以及纤维Asp18与五邻体基底Lys387之间的盐桥。低pH条件可能削弱这种相互作用，使结合于膜上的纤维在洗脱过程中更容易被去除。病毒感染过程中存在两种纤维去除理论：一是纤维与CAR和五邻体与整合素的双重结合导致五邻体构象变化，结合肌动蛋白介导的CAR漂移导致纤维在细胞表面去除；二是内体酸化过程中纤维去除以促进内体逃逸。本研究结果支持低pH在膜结合条件下削弱纤维-五邻体结合的假说。
研究结论指出，AEX纯化过程中的保持时间和低pH条件可导致腺病毒载体纤维蛋白丢失，进而降低感染性。该研究建立了将低温电子断层扫描应用于生物加工条件结构影响评估的分析方法，可推广至其他病毒载体系统。通过理解纯化条件对衣壳结构的损伤机制，可为优化腺病毒载体生产工艺、降低制造成本、提高产品质量提供科学依据，最终改善腺病毒疫苗和基因疗法的有效性和安全性。
