《Frontiers in Molecular Neuroscience》：miR-378f targets CAB39 to regulate autophagy in chemotherapy-induced peripheral neuropathy
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化疗是最常见的癌症治疗方法，因其能够有效破坏癌细胞。然而，外周神经病变是一个显著的副作用，目前尚无明确的预防或治疗方法。尽管针对多种疾病已开发出基于microRNA（miRNA）的各种治疗策略，但miRNA在神经再生中的作用尚未阐明。研究人员此前鉴定了接受XE
化疗是最常见的癌症治疗方法，因其能够有效破坏癌细胞。然而，外周神经病变是一个显著的副作用，目前尚无明确的预防或治疗方法。尽管针对多种疾病已开发出基于microRNA（miRNA）的各种治疗策略，但miRNA在神经再生中的作用尚未阐明。研究人员此前鉴定了接受XELOX（卡培他滨和奥沙利铂）化疗的胃癌患者血浆中五种差异表达的miRNA。其中，仅有miR-378f显示出与外周神经病变严重程度的显著相关性，这为本研究提供了依据。生物信息学分析进一步预测钙结合蛋白39（calcium-binding protein 39, CAB39）——一种自噬调节因子——是这些miRNA的共同靶点。下调miR-378f可增加CAB39表达，激活AMPK并抑制mTOR。此外，观察到自噬相关标志物的变化，包括Beclin-1表达增加、LC3-I向LC3-II转化升高以及p62表达降低。本研究结果表明，由miR-378f介导的自噬调控可能成为外周神经病变的新型诊断和治疗靶点。
一、研究背景与科学问题
化疗诱导的外周神经病变（CIPN）是多种抗癌药物常见且剂量限制性的不良反应，可能在治疗后长期持续存在，严重影响患者生活质量，甚至导致化疗减量或中断。XELOX方案（卡培他滨和奥沙利铂）广泛用于晚期胃癌治疗，但奥沙利铂的神经毒性尤为突出。因此，理解奥沙利铂诱导外周神经损伤相关的分子应答机制，对于识别参与神经元保护与修复的通路至关重要。
MicroRNA（miRNA）是一类长约21-23个核苷酸的小型非编码RNA，通过与靶mRNA的互补序列结合来调控基因表达。特定miRNA的失调已被证实与癌症、神经系统疾病和炎症等多种病理过程相关。已有证据表明，miRNA可通过调节氧化应激、神经炎症、轴突生长及自噬相关通路，积极参与神经元应激反应和再生过程。
研究人员前期通过小RNA测序，在接受XELOX化疗的胃癌患者血浆中鉴定出五种差异表达的miRNA：hsa-miR-4666a-3p、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-378f和hsa-miR-27b-3p。后续RT-qPCR验证显示，仅miR-378f与外周神经病变严重程度呈统计学显著相关。同时，TargetScan分析预测钙结合蛋白39（CAB39）——一种参与细胞增殖和自噬调控的基因——可能是miR-378f的潜在靶点。这些发现促使研究人员进一步探究miR-378f是否通过CAB39调控神经细胞中的自噬相关信号通路。
自噬是一种受遗传控制的动态细胞过程，涉及双层膜自噬体的形成以包裹胞质成分。在外周神经系统中，自噬对神经修复尤为重要，因为外周神经在损伤后仍保有显著的再生能力。AMPK/mTOR通路是自噬的中心调控轴，AMPK活化可抑制mTOR从而诱导自噬通量。而CAB39是AMPK的已知激活因子，这使其成为连接miR-378f与自噬依赖性神经再生的潜在分子桥梁。本研究旨在验证这一假说，探究miR-378f与CAB39在神经元细胞中的功能关系，表征下游自噬通路，并在患者来源样本中验证该机制的临床相关性。
二、主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系进行体外实验；通过脂质体转染法将miR-378f模拟物（mimic）和抑制剂（inhibitor）导入细胞，以实现miR-378f的过表达和敲低；运用双荧光素酶报告基因实验验证miR-378f与CAB39 3‘-UTR的直接结合；利用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测CAB39、AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、mTOR、磷酸化mTOR（p-mTOR）以及自噬相关蛋白Beclin-1、p62和LC3的表达水平；采用RT-qPCR定量检测细胞及临床样本中miR-378f、CAB39、Beclin-1和LC3-II的mRNA表达水平。临床样本来源于2021年1月至10月期间在韩国釜山国立大学医院（PNUH）接受XELOX治疗的10例晚期胃癌患者的血液样本。
三、研究结果
3.1 CAB39作为miR-378f的潜在靶基因
通过miRNet进行的生物信息学分析显示，在五种差异表达miRNA的预测靶基因中，SEC24A和CAB39均被至少三种候选miRNA靶向。CAB39因是miR-378f的预测靶点而被选中进行后续分析。
3.2 miR-378f的过表达与抑制
通过优化转染条件确定最佳时间为24小时、最佳浓度为30 μM。在此条件下，miR-378f模拟物成功实现过表达，抑制剂成功实现敲低。
3.3 miR-378f表达影响神经突长度
显微镜观察显示，miR-378f抑制剂处理使SH-SY5Y细胞的神经突长度显著延长，而miR-378f模拟物则使神经突长度缩短。分支数量方面，抑制剂组显著增加，模拟物组略有减少但无统计学差异。结论表明，下调miR-378f对神经细胞神经突生长具有积极作用。
3.4 miR-378f对神经细胞自噬调控的影响
蛋白质免疫印迹结果显示，抑制miR-378f可增加Beclin-1蛋白表达、降低p62蛋白表达；而过表达miR-378f则产生相反效应。
3.5 miR-378f直接靶向CAB39
STRING分析揭示了CAB39与AMPK、mTOR及多种自噬相关蛋白（包括Beclin-1、LC3、p62、ULK1和ATG家族蛋白）之间的关联网络。双荧光素酶报告实验证实，miR-378f可直接与CAB39的3’-UTR结合：共转染CAB39野生型（WT）3‘-UTR与miR-378f抑制剂可增加荧光素酶活性，而与miR-378f模拟物共转染则降低活性；突变型（MUT）3’-UTR则无显著差异。
3.6 miR-378f/CAB39调控AMPK/mTOR信号及自噬相关蛋白
蛋白质免疫印迹显示，miR-378f抑制剂增加CAB39表达，模拟物则抑制其表达。总AMPK和总mTOR表达在各组间无显著差异。磷酸化AMPK（p-AMPK）在抑制剂组升高、模拟物组降低；磷酸化mTOR（p-mTOR）在抑制剂组降低、模拟物组升高。这表明miR-378f通过调控CAB39表达来调节AMPK/mTOR信号。进一步检测自噬相关蛋白发现，miR-378f抑制剂增加了Beclin-1表达和LC3-II/I比值，降低了p62表达；模拟物则产生相反效果。这些变化表明，下调miR-378f有助于激活自噬相关分子应答。
3.7 胃癌合并CIPN患者中miR-378f调控的临床验证
对胃癌患者血液样本的RT-qPCR分析显示，与低严重度CIPN组（Group 1，<4周期化疗）相比，高严重度CIPN组（Group 2，≥4周期化疗）中miR-378f表达显著降低，而CAB39水平显著升高，同时自噬标志物Beclin-1和LC3-II也显著上调。这表明随着外周神经病变严重程度增加，自噬增强，可能有助于促进外周神经再生。
四、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，随着癌症治疗进步带来幸存者增多，CIPN等长期并发症日益成为重要的临床问题。前期研究已证明miR-378f降低与CIPN严重程度相关。本研究在此基础上，证实了CAB39是miR-378f的直接靶点，且miR-378f下调可解除对CAB39的抑制，进而通过CAB39/AMPK-mTOR通路激活自噬相关分子应答。具体而言，miR-378f抑制导致CAB39表达升高，伴随AMPK磷酸化增加和mTOR磷酸化降低，同时自噬相关蛋白Beclin-1升高、p62降低、LC3-II/I比值升高，并与神经突生长增加平行发生。在CIPN背景下，这些发现提示自噬相关信号的激活可能是化疗所致神经元应激的一种适应性应答。
研究结论认为，本研究发现miR-378f/CAB39调控可作为CIPN中AMPK/mTOR信号、自噬相关应答与神经元修复之间的潜在分子联系。miR-378f下调可能代表一种代偿性分子应答，有助于神经元修复。该机制可能为外周神经病变提供新的诊断和治疗靶点。
