《Journal of Agriculture and Food Research》：Modulating Folate Metabolism and Thymidylate Synthase in Diabetic Retinopathy: Zebrafish Insights and the Prophylactic Potential of
Mesona chinensis
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糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病微血管疾病的主要并发症，也是全球视力损害的主要原因之一。尽管玻璃体腔内抗血管内皮生长因子（anti-vascular endothelial growth factor, anti-V
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病微血管疾病的主要并发症，也是全球视力损害的主要原因之一。尽管玻璃体腔内抗血管内皮生长因子（anti-vascular endothelial growth factor, anti-VEGF）治疗等临床手段改善了疾病管理，但这些干预措施具有侵入性、费用高昂，且不适合长期预防。因此，非侵入性、基于饮食的策略日益受到关注。叶酸（维生素B9）是参与细胞生长、组织再生和血管发育的必需微量营养素，在细胞内作为叶酸介导的一碳代谢（folate-mediated one-carbon metabolism, OCM）中一碳单位的载体，支持核苷酸生物合成、甲基化反应和氧化还原稳态。然而，膳食叶酸化学性质不稳定，过度补充也引发了代谢失衡的担忧。尽管叶酸缺乏（folate deficiency, FD）在神经发育中的作用已被广泛研究，但叶酸稳态在糖尿病条件下视网膜微血管稳定性中的作用仍知之甚少。斑马鱼（Danio rerio）因其光学透明、发育迅速和心血管结构保守，为研究饮食-代谢-血管相互作用提供了有力的脊椎动物模型。研究人员利用先前建立的可诱导细胞内叶酸缺乏的转基因斑马鱼模型，发现叶酸稳态的破坏会损害视网膜血管发育。在此基础上，研究人员鉴定出胸苷酸合成酶（thymidylate synthase, TYMS）——OCM胸苷酸循环中的关键酶——是高糖应激下选择性上调并促进病理性视网膜过度血管生成的代谢介质。从营养学角度出发，这些发现凸显了对能够调节叶酸依赖性代谢通路且不引起全身毒性的稳定食物源化合物的需求。凉粉草（Mesona chinensis, Mc）是东亚地区广泛作为凉茶和功能性食品成分食用的传统植物，富含多酚和黄酮类化合物，具有长期食用历史和良好的安全性。本研究利用转基因幼鱼和成年斑马鱼模型，结合体外内皮细胞实验和分子对接分析，系统研究了Mc提取物是否调节高糖诱导的视网膜血管生成反应，并探讨叶酸介导OCM（特别是胸苷酸通路）的潜在参与机制。研究结果表明，高糖病理性地上调TYMS，驱动视网膜过度血管生成和微血管异常；TYMS介导的血管缺陷在斑马鱼中呈现明显的组织特异性模式；Mc提取物选择性抑制TYMS活性并抑制葡萄糖诱导的视网膜血管分支；在慢性高糖应激下，Mc处理维持了斑马鱼幼鱼的功能性视觉反应；Mc中的槲皮素（quercetin）竞争性结合TYMS活性位点，为有毒合成抗叶酸药物提供了更安全的抗血管生成替代方案。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病微血管疾病的主要并发症，以代谢失调、内皮功能障碍和视网膜内病理性血管生成为特征，最终损害视功能，是全球视力损害的主要原因之一。尽管玻璃体腔内抗血管内皮生长因子（anti-vascular endothelial growth factor, anti-VEGF）治疗改善了疾病管理，但这些干预具有侵入性、费用高昂且不适合长期预防，因此非侵入性、基于饮食的微血管健康支持策略日益受到关注。
叶酸（维生素B9）是参与细胞生长、组织再生和血管发育的必需微量营养素，在细胞内作为叶酸介导的一碳代谢（folate-mediated one-carbon metabolism, OCM）中一碳单位的载体，支持核苷酸生物合成、甲基化反应和氧化还原稳态。然而，膳食叶酸化学性质不稳定，过度补充也引发代谢失衡和意外生物效应的担忧。尽管叶酸缺乏（folate deficiency, FD）在神经发育中的作用已被广泛研究，但叶酸稳态在糖尿病条件下视网膜微血管稳定性中的作用仍不清楚。此外，糖尿病血管病变具有高度组织特异性，反映不同血管床内皮细胞间的代谢异质性，而营养失衡可加剧氧化应激、改变核苷酸代谢并使内皮细胞对病理信号敏感化，提示膳食成分可能作为血管生成的有效调节剂。
基于上述背景，本研究旨在探讨凉粉草（Mesona chinensis, Mc）——东亚地区广泛食用的传统凉茶和功能性食品成分——是否能调节高糖诱导的视网膜血管生成反应，并探索叶酸介导OCM（特别是胸苷酸通路）的潜在参与机制。
二、研究内容与主要发现
研究人员利用转基因斑马鱼幼鱼和成年模型，结合体外内皮细胞实验和分子对接分析，系统评估了Mc对高糖条件下视网膜微血管改变、视觉功能和TYMS依赖性代谢网络的影响。主要发现包括：高糖病理性地上调胸苷酸合成酶（thymidylate synthase, TYMS），驱动视网膜过度血管生成和微血管异常；TYMS介导的血管缺陷呈现组织特异性模式；Mc提取物选择性抑制TYMS活性并抑制葡萄糖诱导的视网膜血管分支；Mc处理在慢性高糖应激下维持斑马鱼幼鱼的功能性视觉反应；Mc中的槲皮素（quercetin）竞争性结合TYMS活性位点，为有毒合成抗叶酸药物提供了更安全的抗血管生成替代方案。
三、关键技术与方法
本研究整合了多项关键技术平台：利用可诱导叶酸缺乏的转基因斑马鱼系Tg(lfabp:eGFP/hsp:mCherry-γGH/fli-1:eGFP)（来自台湾斑马鱼核心设施）进行体内研究，采用100 mM D-葡萄糖浸泡诱导幼鱼高糖相关视网膜血管改变，通过晶状体分离和透明质血管分支点定量评估视网膜血管形态；使用成年斑马鱼眶后静脉窦注射25%葡萄糖建立成熟血管系统的高糖模型；采用视动反应（optomotor response, OMR）实验评估幼鱼视觉功能；利用高效液相色谱（HPLC）定量分析叶酸衍生物组成；使用RF/6A猴脉络膜视网膜内皮细胞和HMEC-1人皮肤微血管内皮细胞进行体外实验；通过Western blotting和RT-PCR检测基因和蛋白表达；采用Alamar Blue法评估细胞活力；运用SwissDock和AutoDock Vina进行分子对接分析；并对糖尿病小鼠视网膜转录组数据（GEO数据集GDS3657）进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）。
四、研究结果
调节叶酸稳态影响视网膜透明质血管生成。 通过可诱导叶酸缺乏的转基因斑马鱼模型，研究人员发现FD诱导后视网膜透明质血管分支点显著减少；使用二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）抑制剂甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）也显著降低血管分支点，而叶酸补充则显著增加视网膜血管分支，表明视网膜血管发育对叶酸可用性敏感。
干扰叶酸稳态减弱高糖诱导的视网膜过度血管生成。 在100 mM葡萄糖诱导的视网膜过度血管生成模型中，FD幼鱼的葡萄糖诱导血管分支增加被减弱；MTX、葡萄籽提取物（grape seed extract, GSE）及其活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG）处理均显著减少葡萄糖诱导的视网膜血管分支增加，支持叶酸代谢与高糖条件下血管生成反应之间的关联。
胸苷酸循环上调与高糖诱导的视网膜过度血管生成相关。 葡萄糖暴露的斑马鱼幼鱼头部区域中tyms、dhfr、mthfd1l、mthfr和mtr的mRNA表达显著增加，其中TYMS蛋白水平升高最为显著；RF/6A和HMEC-1内皮细胞暴露于葡萄糖后TYMS蛋白水平也显著增加；外源性脱氧胸苷三磷酸（deoxy-thymidine triphosphate, dTTP）——TYMS活性的下游代谢产物——在无葡萄糖暴露情况下也显著增加视网膜透明质血管分支；糖尿病小鼠视网膜转录组数据GSEA分析显示叶酸介导OCM相关基因显著富集。
TYMS升高导致组织特异性血管生成缺陷。 通过显微注射mCherry–Tyms合成mRNA进行过表达实验，TYMS过表达幼鱼视网膜透明质血管分支显著增加，但节间血管（intersegmental vessels, ISV）发育和肠下血管（sub-intestinal vessels, SIV）面积减少；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）——TYMS抑制剂——减少基础视网膜血管生成并减弱葡萄糖诱导的过度血管生成，而dTTP补充可逆转这一抑制作用；外源性dTTP补充促进视网膜血管分支但不影响SIV发育，表明胸苷酸通路激活的促血管生成反应是组织特异性内皮生物学的固有属性。
凉粉草改变叶酸池组成和斑马鱼幼鱼血管发育。 HPLC分析显示Mc处理的幼鱼二氢叶酸（dihydrofolate, DHF）水平显著降低，而四氢叶酸（tetrahydrofolate, THF）、5-甲基四氢叶酸（5-CH3-THF）和10-甲酰四氢叶酸（10-CHO-THF）水平基本不变，表明Mc选择性改变胸苷酸循环内的细胞内叶酸池；Mc处理导致ISV延伸不完全、视网膜透明质血管分支减少和SIV面积减少，但幼鱼存活正常且无明显的总体形态异常。
凉粉草通过涉及TYMS-dTTP通路的机制调节血管发育。 Mc以剂量依赖方式降低RF/6A和HMEC-1细胞活力，外源性dTTP补充可显著恢复RF/6A细胞活力；在斑马鱼幼鱼中，Mc减少视网膜透明质血管分支，dTTP补充恢复分支点数量，且dTTP减弱Mc对葡萄糖诱导视网膜过度血管生成的抑制作用；dATP/dGTP/dCTP混合物或叶酸补充均不能逆转Mc的抗血管生成效应，排除了整体核苷酸饥饿和整体叶酸池耗竭的机制；Mc处理减弱TYMS过表达引起的躯干血管异常和视网膜过度血管生成，但血管直径无显著差异。
凉粉草在体内和体外减弱高糖诱导的TYMS上调。 葡萄糖暴露显著增加幼鱼组织中tyms和dhfr的mRNA表达，Mc共处理显著降低这一升高；蛋白水平上，Mc补充减弱葡萄糖暴露幼鱼TYMS蛋白的增加，但Mc单独处理不改变基础TYMS表达；RF/6A和HMEC-1细胞中葡萄糖暴露增加TYMS蛋白水平，Mc共处理减弱这一增加。
凉粉草减轻视网膜过度血管生成并改善幼鱼和成年斑马鱼的视觉反应性。 Mc以剂量依赖方式减少葡萄糖诱导的视网膜透明质血管分支增加；葡萄糖暴露幼鱼显示OMR降低（正常反应率27%），Mc共处理幼鱼正常OMR比例提高至84.5%；成年斑马鱼眶后注射葡萄糖增加视网膜血管出芽，Mc共给药减少血管出芽数量；葡萄糖处理导致的SIV面积减少被Mc部分恢复。
槲皮素部分重现凉粉草的血管效应并显示与TYMS的潜在相互作用。 分子对接分析预测槲皮素结合于TYMS活性位点口袋，结合能（?6.605 kcal/mol）优于天然底物脱氧尿苷一磷酸（deoxyuridine monophosphate, dUMP, ?5.325 kcal/mol）和已知抑制剂5-氟-2‘-脱氧尿苷-5’-一磷酸（FdUMP, ?5.572 kcal/mol）；槲皮素处理减少SIV面积和视网膜透明质血管分支，并在葡萄糖暴露幼鱼中减少视网膜血管分支和部分恢复SIV形态。
凉粉草与合成抗叶酸药物相比在斑马鱼幼鱼中表现出良好的发育安全性。 在抑制葡萄糖诱导视网膜血管生成的等效浓度下，Mc处理的幼鱼存活率高且总体形态正常，而MTX和5-FU处理的幼鱼存活率降低并出现轴性躯体弯曲、卵黄囊水肿、心包水肿和游泳 bladder 充气失败等多种发育异常。
五、讨论与结论
本研究鉴定Mc——广泛食用的功能性食品成分——作为高血糖相关视网膜血管生成的调节剂。研究结果表明，高糖通过激活叶酸介导OCM促进视网膜血管生成：高糖暴露增加TYMS表达和视网膜血管生成，葡萄糖可能通过增强丝氨酸合成通路通量，经丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxymethyltransferase, SHMT）生成5,10-亚甲基四氢叶酸——TYMS的关键底物——从而促进胸苷酸依赖性dTMP和dTTP合成，驱动内皮增殖和视网膜血管生成。胸苷酸通路激活产生组织特异性血管效应，视网膜血管生成增强而躯干SIV和ISV发育受抑，反映不同血管床内皮细胞的代谢需求和信号响应差异。Mc通过选择性调节胸苷酸循环内的叶酸池（而非整体叶酸耗竭）发挥作用，其活性成分槲皮素可能通过与TYMS活性位点相互作用参与酶调节。与合成抗叶酸药物相比，Mc在抑制血管生成的等效浓度下未产生可检测的发育毒性，提示通过膳食化合物调节叶酸依赖性核苷酸代谢可能是一种相对温和的血管生成调控策略。
研究结论：高糖病理性地通过上调TYMS驱动视网膜过度血管生成和微血管异常；Mc提取物通过调节叶酸介导OCM（特别是胸苷酸通路）选择性抑制TYMS活性，抑制葡萄糖诱导的视网膜血管分支，并在慢性高糖应激下维持斑马鱼幼鱼的功能性视觉反应；Mc中的槲皮素竞争性结合TYMS活性位点，为有毒合成抗叶酸药物提供了更安全的抗血管生成替代方案。Mc可能代表一种能够在代谢应激条件下调节血管反应的功能性膳食成分。
