《Journal of Agriculture and Food Research》：Preharvest seed treatment with natural antimicrobial formulations to control
Salmonella enterica in microgreens
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微型蔬菜（microgreens）是发芽后约7–21天收获的幼嫩可食用幼苗，其短生产周期、幼苗组织结构脆弱、丰富的植物化学成分以及适宜可控环境农业的特点，推动了其在商业上的广泛普及。芸薹科（Brassicaceae）微型蔬菜因其高硫代葡萄糖苷含量
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微型蔬菜（microgreens）是发芽后约7–21天收获的幼嫩可食用幼苗，其短生产周期、幼苗组织结构脆弱、丰富的植物化学成分以及适宜可控环境农业的特点，推动了其在商业上的广泛普及。芸薹科（Brassicaceae）微型蔬菜因其高硫代葡萄糖苷含量及包括异硫氰酸酯和吲哚类在内的生物活性水解产物而尤为突出。然而，微型蔬菜存在独特的食品安全挑战：促进快速发芽和生长的温暖温度、高相对湿度、高密度播种及营养丰富的基质，同时可能有利于微生物的存活和增殖。污染可能通过种子、灌溉水、生长介质或操作表面引入，而短生产周期限制了纠错干预的机会。由于微型蔬菜通常生食且很少经过有效的采后病原体灭活步骤，采前阶段引入的污染可能持续至收获并到达消费者手中。肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）等食源性病原体与多起新鲜农产品相关疫情有关；其中，S. enterica仍是重大公共卫生问题，在美国每年估计造成135万例感染。在微型蔬菜生产系统中，种子被广泛认为是主要污染途径，因为病原体可在干燥种子上存活并在温暖潮湿的发芽条件下迅速增殖。此外，沙门氏菌可从种皮迁移至新生组织、内化并对表面施用的消毒剂产生抗性。传统种子消毒方法，如氯或过氧化氢基清洗，对内部化或生物膜相关细胞的杀灭效果往往有限，并可能对种子活力和发芽产生不利影响。物理干预措施，包括辐照和热处理，已显示出病原体减少潜力；然而，这些方法可能对娇嫩种子不切实际或与微型蔬菜生产限制不兼容。因此，人们越来越关注在发芽前或发芽期间应用天然、环境兼容的抗菌干预措施。苯甲基异硫氰酸酯（Benzyl isothiocyanate, BIT）是芸薹科植物中天然存在的硫代葡萄糖苷水解产物，已证明对包括S. enterica和E. coli O157:H7在内的多种食源性病原体具有抗菌活性，其机制涉及破坏细胞功能和干扰能量代谢。然而，疏水性抗菌剂的实际应用常受挥发性、有限水溶性和制剂稳定性挑战的制约。基于纳米乳剂（nanoemulsion）的递送系统，通常由食品级表面活性剂稳定的20–200 nm油滴组成，已被证明可增强分散性、改善稳定性并在较低浓度下提高抗菌效果。尽管BIT和基于精油的制剂（包括Sporan）等天然抗菌剂已在各种食品基质中显示出对S. enterica和E. coli O157:H7的抑制活性，但其在微型蔬菜栽培条件下的效果和兼容性在很大程度上仍未被探索。关于这些处理作为播种前种子处理在更广泛的采前安全框架内如何影响种子发芽、早期植物发育、微型蔬菜产量以及不同微型蔬菜品种中S. enterica的持续性，现有信息有限。本研究旨在评估BIT纳米乳剂（1%，v/v）和商业植物杀菌剂乳剂（Sporan，2%，v/v）作为采前干预措施在微型蔬菜生产系统中减少S. enterica的效果。具体而言，本研究评估了五种芸薹科微型蔬菜品种中的体外抗菌活性、种子消毒效果以及病原体在微型蔬菜组织和生长介质/土壤上的持续性。
论文解读文章
一、研究背景与目的
微型蔬菜是发芽后约7–21天收获的幼嫩可食用幼苗，因其短生产周期、丰富的植物化学成分以及适合可控环境农业等特点，在商业上广受欢迎。芸薹科微型蔬菜因含有较高的硫代葡萄糖苷及其水解产物异硫氰酸酯和吲哚类化合物而尤为突出。然而，微型蔬菜生产面临独特的食品安全挑战。促进快速发芽和生长的温暖温度、高相对湿度、高密度播种和营养丰富的基质，同时也可能有利于微生物的存活和增殖。污染可能通过种子、灌溉水、生长介质或操作表面引入，而短生产周期限制了纠正干预的机会。由于微型蔬菜通常生食且很少经过有效的采后病原体灭活步骤，采前阶段引入的污染可能持续至收获并到达消费者。肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）是重要的食源性病原体，在美国每年估计造成135万例感染。
在微型蔬菜生产系统中，种子被广泛认为是主要污染途径，病原体可在干燥种子上存活并在温暖潮湿的发芽条件下迅速增殖。沙门氏菌还可从种皮迁移至新生组织、内化并对表面施用的消毒剂产生抗性。传统种子消毒方法如氯或过氧化氢基清洗，对内部化或生物膜相关细胞的杀灭效果有限，并可能影响种子活力和发芽。物理干预如辐照和热处理虽具潜力，但对娇嫩种子可能不切实际。因此，需要有效的采前预防控制措施。苯甲基异硫氰酸酯（BIT）是芸薹科植物中天然存在的硫代葡萄糖苷水解产物，具有广谱抗菌活性，但受挥发性、有限水溶性和制剂稳定性挑战的制约。纳米乳剂递送系统可增强疏水性抗菌剂的分散性、稳定性和抗菌效果。本研究旨在评估1% BIT纳米乳剂和2% Sporan商业植物杀菌剂乳剂作为采前干预措施，在五种芸薹科微型蔬菜生产系统中减少S. enterica的效果。
二、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法开展研究。体外抗菌活性通过纸片扩散法（disk diffusion assay）评估，使用五种S. enterica血清型（Give、Typhimurium、Newport、Braenderup和Anatum），以庆大霉素为阳性对照。种子接种采用四种S. enterica血清型（Bareilly、Derby、Heidelberg和Typhimurium）制备多菌株混合接种物，以1:2（w/v）比例与种子混合并在300 rpm下振荡15分钟促进细菌附着。种子处理包括水对照、1% BIT纳米乳剂和2% Sporan乳剂，浸泡15分钟加5分钟静态接触时间。微型蔬菜在受控环境生长室中栽培14天，种子在29°C和85%相对湿度下暗处发芽3天，随后在24°C和65%相对湿度、16小时光照/8小时黑暗光周期下生长。沙门氏菌计数采用XLT4琼脂平板计数法，种子样品在第0天分析，微型蔬菜和土壤样品在第7天和第14天采集分析。种子发芽率在培养3天后记录胚根突出情况。产量在第14天以每托盘克数表示。统计分析使用SAS软件PROC MIXED程序，最小显著差数法（LSD）进行均值分离，显著性水平设为p<0.05。种子和盆栽土壤均来自商业供应商，实验前经XLT4琼脂筛选确认无沙门氏菌污染。
三、研究结果
3.1 体外抗菌活性。 纸片扩散法测定结果显示，BIT产生的抑菌圈直径为12.30±0.60 mm至13.80±0.60 mm，Sporan产生的抑菌圈直径为9.00±0.40 mm至10.50±0.60 mm。BIT对所有S. enterica血清型总体产生的抑菌圈显著大于Sporan（p<0.05），抑菌效果顺序为庆大霉素>BIT>Sporan>对照。
3.2 处理对种子发芽的影响。 水处理对照组在所有品种中均表现出持续高发芽率，范围为红俄罗斯羽衣甘蓝的79.70±3.80%至樱桃萝卜的98.70±3.80%。Sporan处理表现出物种依赖性反应，西兰花（88.30±3.80%）和红卷心菜（83±3.80%）保持较高发芽率，而樱桃萝卜（32±3.80%）、芥菜（42.70±3.80%）和红俄罗斯羽衣甘蓝（46.70±3.80%）显著降低。BIT处理种子普遍发芽率较低，红俄罗斯羽衣甘蓝最敏感（7.30±3.80%），而樱桃萝卜（68.70±3.80%）、红卷心菜（62.50±4.60%）和西兰花（61±3.80%）保持中等水平。处理×品种交互作用显著（p<0.05）。
3.3 抗菌剂对微型蔬菜产量的影响。 产量在不同品种间差异显著（p<0.05），但处理效应除樱桃萝卜外均不显著。西兰花在所有处理下产量最高，水处理（239.70±22.40 g）、BIT（237.30±22.40 g）和Sporan（227.70±22.40 g）之间无显著差异。BIT处理的樱桃萝卜产量（97.30±22.40 g）显著低于水处理（202±22.40 g）和Sporan处理（218.30±22.40 g）（p<0.05）。
3.4 抗菌剂对种子上S. enterica的减少效果。 抗菌种子处理在所有五种微型蔬菜品种中均显著减少S. enterica种群（p<0.05）。芥菜和红俄罗斯羽衣甘蓝种子上的减少最为显著。芥菜中，S. enterica从3.28±0.20 log CFU/g分别降至BIT处理的1.13±0.16和Sporan处理的1.66±0.10 log CFU/g。红俄罗斯羽衣甘蓝中，从3.37±0.29 log CFU/g分别降至1.55±0.17和1.63±0.07 log CFU/g。BIT在所有品种中总体表现出比Sporan更强的抗菌效果，最大减少量达2.15 log CFU/g（BIT）和1.74 log CFU/g（Sporan）。
3.5 微型蔬菜组织中的S. enterica种群。 收获的微型蔬菜组织中回收的S. enterica随处理、品种和采样日变化。大多数品种第14天的病原体种群低于第7天，但西兰花和樱桃萝卜的减少不显著。BIT处理的红卷心菜微型蔬菜中沙门氏菌从第7天的3.34±0.30降至第14天的2.13±0.30 log CFU/g（Δ=1.21 log CFU/g；p<0.05）。红俄罗斯羽衣甘蓝从3.99±0.30降至2.21±0.30 log CFU/g（Δ=1.78 log CFU/g；p<0.05）。Sporan和水处理仅产生边际减少（≤0.7 log CFU/g）。芥菜总体计数最低，范围为0.47±0.30至1.61±0.30 log CFU/g。
3.6 土壤中的S. enterica种群。 生长基质中回收的S. enterica种群约为3.2至5.9 log CFU/g。统计分析显示处理、采样日及处理×日交互作用均无显著效应（p>0.05）。第7天至第14天之间观察到土壤中病原体种群增加，但差异不显著。抗菌种子处理未在14天栽培期内对土壤中S. enterica种群产生持续抑制。
四、讨论与结论
讨论部分指出，BIT和Sporan乳剂均可显著减少微型蔬菜系统中种子携带的S. enterica污染，其中BIT提供更大且更持续的减少效果。BIT的增强效果与其作为十字花科蔬菜衍生的异硫氰酸酯化合物的既定抗菌特性一致，其作用机制涉及破坏细菌膜、与关键代谢酶中含硫氨基酸相互作用、干扰呼吸链中氢离子转移、损害ATP合成和破坏氧化代谢。纳米乳剂形式增强了疏水化合物的分散性，增加了微生物相互作用表面积，并可能改善稳定性。种子处理对土壤病原体动态无显著影响，表明种子施用干预主要影响种子携带和组织相关污染，而非提供持续的土壤消毒效果。尽管某些品种的早期发芽出现物种特异性延迟，但第14天可收获的生物量产量在大多数品种中未受影响。这些发现支持将天然抗菌种子处理，特别是BIT纳米乳剂，作为可控环境微型蔬菜栽培中多重屏障食品安全计划中的可行采前干预措施。
研究结论为：播种前施用1% BIT纳米乳剂和2% Sporan可显著减少芸薹科微型蔬菜生产系统中的S. enterica污染。BIT在接种种子上实现高达2.15 log CFU/g的减少，并在整个栽培期间在可食用组织上维持显著较低的病原体载量，最大组织减少量见于红俄罗斯羽衣甘蓝（1.78 log CFU/g）和红卷心菜（1.21 log CFU/g）。Sporan提供中等但显著的种子消毒效果（高达1.74 log CFU/g减少）。重要的是，两种处理均未改变土壤病原体动态，尽管早期发芽出现轻微物种特异性延迟，但大多数品种第14天的可收获生物量产量未受影响。这些发现支持将天然抗菌种子处理，特别是BIT纳米乳剂，整合到可控环境微型蔬菜栽培的多重屏障食品安全计划中作为可行的采前干预措施。
