《Journal of Chromatography A》：Offline two-dimensional liquid chromatography-electrochemical detection combined with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry for comprehensive characterization and antioxidant activity evaluation of
Ilex asprella leaves
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•离线LC×LC-ECD联用HRMS筛选出Ilex asprella叶片中的抗氧化成分。•通过HRMS表征了48种抗氧化成分，主要为酚酸类和黄酮苷类。•ECD信号强度与DPPH和ABTS活性呈显著正相关。•LC-ECD指纹图谱揭示了不同产地样品图谱的显著差异。引言Ilex a
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离线LC×LC-ECD联用HRMS筛选出Ilex asprella叶片中的抗氧化成分。
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通过HRMS表征了48种抗氧化成分，主要为酚酸类和黄酮苷类。
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ECD信号强度与DPPH和ABTS活性呈显著正相关。
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LC-ECD指纹图谱揭示了不同产地样品图谱的显著差异。
引言
Ilex asprella（硬毛冬青）（Hook. & Arn.）Champ. ex Benth.是一种落叶灌木，主要分布于华南地区，包括广东、广西、福建、湖南和江西等省份。其根、茎、叶在传统民间医药中均有应用[1,2]。作为一种典型的药食两用植物，Ilex asprella是王老吉、夏桑菊等经典岭南凉茶的核心原料，也是感冒灵颗粒、复方岗梅片等清热解毒类中药成药的关键组分。现代药理学研究证实，Ilex asprella提取物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等多种生物活性[[3], [4], [5], [6]]。其活性成分主要包括黄酮类、酚酸类、多糖类、三萜皂苷类和挥发油类。其中，黄酮类和酚酸类富含酚羟基，是赋予其抗氧化活性的核心生物活性成分[7]。目前，针对Ilex asprella的化学和药理学研究多集中于其根和茎，已分离鉴定出冬青皂苷、齐墩果酸、绿原酸、山柰酚和槲皮素等100余种成分[[8], [9], [10]]。然而，关于Ilex asprella叶片化学成分及抗氧化活性的研究相对匮乏，限制了该植物资源的开发利用。
药用植物化学成分复杂，各成分的含量和极性差异显著。传统一维液相色谱的峰容量和分离度有限[11]，难以在单次分析中有效分离极性范围广、含量差异大的复杂成分。这往往导致关键微量活性成分被高丰度成分遮盖或共洗脱，阻碍其检测，甚至使其被忽视。二维液相色谱（LC×LC）利用两根具有不同分离机制的色谱柱构建正交分离体系，显著提高了复杂样品的分离效率和峰容量[[12], [13], [14]]。该方法有效解决了复杂中药基质中成分共洗脱的问题，有利于微量成分的发现和表征。
传统的抗氧化成分筛选方法通常依赖于逐一分离纯化后进行单独的活性测定。这些过程劳动密集、效率低下，且往往无法准确反映复杂植物基质中多成分的协同效应。在液相色谱常用的检测技术中，电化学检测（ECD）具有高灵敏度和高选择性，可特异性响应可氧化或可还原的化合物[[15], [16], [17]]。因此，ECD可用于天然产物中酚酸类和黄酮类等抗氧化成分的靶向筛选。LC×LC联用抗氧化活性检测方法已成功应用于多种天然产物中抗氧化成分的筛选[18, 19]。例如，离线LC×LC-DPPH-UV/MS系统已用于复杂植物提取物中自由基清除剂的快速筛选[20]；在线LC×LC-ABTS-DAD-MS方法实现了抗氧化活性化合物的实时检测和结构鉴定[21]。与在线LC×LC相比，离线LC×LC的操作程序更为繁琐，分析时间更长，且在维度间转移过程中可能存在样品稳定性问题。然而，其主要优势在于一维馏分可以被收集和保存，便于后续进行全面的生物活性评价和高分辨质谱的深入结构鉴定。此外，离线模式不受两个维度间溶剂不相容的限制，允许对每个维度的色谱条件进行独立优化，从而提供了更大的方法开发灵活性[22, 23]。
通过将ECD与离线LC×LC技术联用，可基于高效分离检测各馏分中的电活性成分，从而增强抗氧化成分筛选的选择性和准确性[24, 25]。鉴于LC×LC的高分辨率和高选择性，将LC-HRMS[[26], [27], [28]]与LC×LC结合，不仅提高了微量成分的检测灵敏度，还实现了对一维馏分中化学成分的快速准确结构表征[[29], [30], [31]]。通过结合LC×LC的高分离能力、质谱的鉴定能力以及ECD对抗氧化成分的选择性，该方法实现了抗氧化成分的快速准确筛选。
本研究采用LC×LC-ECD方法筛选Ilex asprella叶片中的抗氧化成分。同时，采用1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）和2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）自由基清除法评价其总抗氧化活性。结合LC-HRMS数据进行结构鉴定，研究了Ilex asprella叶片的化学成分和抗氧化活性，旨在为Ilex asprella叶片资源的开发利用提供参考。
分节摘要
试剂与化学品
色氨酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C购自阿拉丁生化科技有限公司（上海，中国）。新绿原酸、牡荆素和异槲皮苷购自成都普菲生物科技有限公司（成都，中国）。所有对照品的纯度均≥98%。甲醇和乙腈为HPLC级别，购自上海国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）。所有
LC×LC-ECD分离
经LC-UV分离Ilex asprella叶片后，所有色谱峰均呈对称形状，基线稳定（图1A），代表了离线LC×LC系统的一维LC分离。然而，在较窄的保留时间窗口内洗脱了大量色谱峰，特别是在15-50分钟区间内，出现严重的峰重叠现象，许多微量成分被相邻的主成分所遮盖。许多紧密洗脱的化合物无法达到基线分离。
结论
本研究采用离线LC×LC-ECD联用LC<—>HRMS系统，系统地分离鉴定了Ilex asprella叶片中的主要抗氧化成分，并评价了不同产地样品的质量。离线LC×LC有效弥补了一维LC分离复杂样品的不足。结合ECD的活性导向筛选和HRMS的结构鉴定能力，抗氧化成分的发现效率得到了显著提高。
CRediT作者贡献声明
王彪（Piao Wang）：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，软件，方法学，数据管理。潘伟（Wei Pan）：验证，软件，数据管理。王丹（Dan Wang）：验证，调查研究。陈玉（Yu Chen）：形式分析。陈欣锐通（Xinruitong Chen）：形式分析。徐佩（Pei Xu）：调查研究。谭正燕（Zhengyan Tan）：可视化。欧水萍（Shuiping Ou）：监督指导，概念构思。王森（Sen Wang）：监督指导，资源，概念构思。陈荣祥（Rongxiang Chen）：撰写——审阅与编辑，监督指导，资源，项目管理，
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
作者感谢以下资助来源：贵州省自然科学基金（ZK[2024]?277）、2024年度东莞市医学领军人才引进培育计划、遵义医科大学医工结合硕士生未来人才计划（编号20221040）。
王彪|潘伟|王丹|陈玉|陈欣锐通|徐佩|谭正燕|欧水萍|王森|陈荣祥
