《Journal of Chromatography B》：An integrated De novo sequencing and virtual screening strategy for the discovery of low-abundance natural peptides with potential bioactivities from Asini Corii Colla
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•从头测序技术实现了对阿胶中天然肽的高覆盖度分析。•开发了一种集成策略，用于发现具有潜在生物活性低丰度天然肽。•虚拟筛选快速鉴定出阿胶中具有潜在ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的天然肽。引言阿胶（Asini Corii Colla，ACC）是由马科Equidae动物驴的干
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从头测序技术实现了对阿胶中天然肽的高覆盖度分析。
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开发了一种集成策略，用于发现具有潜在生物活性低丰度天然肽。
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虚拟筛选快速鉴定出阿胶中具有潜在ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的天然肽。
引言
阿胶（Asini Corii Colla，ACC）是由马科Equidae动物驴的干皮或鲜皮经煎煮浓缩制成的固体明胶[1]。最早记载于《神农本草经》[2]。研究表明，肽是阿胶药理作用的重要物质基础之一[3], [4]，包括蛋白酶解来源肽和天然肽[5], [6]。目前针对阿胶中肽的研究主要集中于蛋白酶解来源肽，其中部分已被报道具有潜在的造血[7]、抗氧化[3]、抗高血压及抗肿瘤活性[8]。然而，蛋白酶解来源肽大多来源于体外酶解或模拟消化过程，其组成受酶切方式和样品制备流程的影响，因此不能完全代表原始阿胶样品中固有的肽成分。
天然肽主要在体内通过三条途径形成，包括蛋白质降解、基因编码合成和基因非依赖性酶促反应[9]。由于天然肽不需要酶解[10]，因此能更好地反映阿胶的真实肽谱。对天然肽的系统表征有助于发现与药理功效相关的肽并实现质量评价。然而，蛋白质降解机制的复杂性和缺乏固定酶切位点等因素导致了天然肽组成的复杂性。同时，天然肽在复杂生物体系中通常处于相对较低的丰度水平，可能受到蛋白质、脂质、盐类及其他基质成分的干扰，从而影响其质谱响应和检测效率[9], [11]。综合来看，这些因素增加了天然肽系统鉴定和表征的难度。因此，构建天然肽的高覆盖度分析方法并探索其功能活性，对于进一步阐明阿胶药理作用的物质基础具有重要意义。
目前肽序列表征方法主要包括数据库搜索和从头测序。数据库搜索依赖于目标物种的蛋白质数据库，可从UniProt等资源获取。Li等人[12]利用UniProt中的水蛭（Hirudinea）蛋白质数据库，从不同品种的水蛭中鉴定出600至2000条肽。数据库搜索策略能够实现动物源性传统药物中的肽鉴定，但该策略局限于数据库中已知蛋白来源的肽，无法鉴定未注释蛋白或数据库中未记录的基因编码肽序列[13]。
对于蛋白质数据库注释不佳的非模式物种，也可利用目标物种的转录组数据构建蛋白质数据库并用于肽鉴定[14]。Liu等人[15]利用纳升液相色谱-串联质谱（NanoLC-MS/MS）分析参环毛蚓（Pheretima aspergillum）样品，以基于参环毛蚓转录组数据构建的物种特异性蛋白质数据库搜索MS/MS光谱，最终鉴定出2727个蛋白和8658条肽。与直接使用UniProt等公共数据库相比，基于转录组数据构建的物种特异性蛋白质数据库可以弥补目标物种蛋白质序列信息的不足，从而提高非模式物种中蛋白和肽鉴定的覆盖度[10]。然而，该方法仍受转录组测序深度和组装质量等因素的制约。本质上，它仍然依赖于现有序列信息，因此在鉴定蛋白来源未知、切割模式不规则或数据库未收录的天然肽方面存在局限性。
从头测序不依赖于现有蛋白质数据库，而是直接利用b型和y型碎裂离子以及相邻碎裂离子间的m/z差值来推断对应的氨基酸残基，从而确定肽序列[16]。由于不需要预先了解氨基酸序列信息，该方法可以直接确定未知肽的氨基酸序列[17]，从而有助于天然肽的鉴定。Castro等人[18]分析了Natterer裸蛙（Physalaemus nattereri）的皮肤来源天然肽，并利用PEAKS对MS/MS光谱进行从头测序。值得注意的是，他们共鉴定出149条肽，其中仅有32条能在UniProt两栖动物数据库中找到前体蛋白。该研究表明，当目标物种的肽序列信息有限时，从头测序能有效补充动物源性天然肽的发现与序列表征。
蛋白酶解来源肽通常是通过特定蛋白酶（如胰蛋白酶和LysC）对已知蛋白质的特异性水解产生的。其形成遵循相对明确的切割规则[19]，可通过对目标蛋白质序列进行理论消化并匹配数据库来进行鉴定。相比之下，天然肽并非来源于特定蛋白酶对蛋白质的规则水解，而是在体内通过多种途径形成，包括蛋白质降解和内源蛋白酶的作用，其生成缺乏明确的酶切规则[10], [14]。因此，天然肽在序列组成、长度分布以及N端和C端特征方面表现出更大的复杂性[20]。依赖于蛋白质数据库和理论切割模型的传统鉴定策略无法全面覆盖天然肽。据此，本研究引入从头测序技术以克服对现有蛋白质数据库和固定切割规则的依赖，从而实现对阿胶中天然肽的高覆盖度表征。
在实现天然肽高覆盖度序列表征之后，从复杂的肽混合物中快速识别具有潜在生物活性的肽是探索天然肽生物功能的关键步骤。传统的生物活性肽发现方法主要依赖分离、纯化和活性导向评价，但这些过程往往耗时、费力、成本高昂且缺乏筛选效率[21]。随着生物信息学的发展，整合生物活性预测、理化性质评价、生物活性数据库分析和分子对接的虚拟筛选策略，能够从众多候选肽中快速筛选出具有潜在生物活性的肽并提高筛选效率[22], [23]。分子对接还可以表征生物活性肽与靶蛋白之间的相互作用，为推测潜在作用机制提供参考[24]。先前的研究通过虚拟筛选发现了血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽DLGGFFGFQR[25]以及KYPHVF和LFRPE[26]，表明该策略有助于快速发现复杂天然肽系统中的潜在生物活性肽。
基于此，本研究利用从头测序技术从阿胶中鉴定出4764条天然肽。随后利用Peptide Ranker筛选出152条得分大于0.50的潜在生物活性肽，并通过水溶性、稳定性、安全性和吸收性评价进一步筛选出39条优质肽。BIOPEP-UWM数据库检索表明，这39条肽均具有ACE抑制活性和二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制活性。选取活性得分最高的5条肽进行分子对接，5条肽均能稳定结合ACE和DPP-IV。总之，本研究建立了一种发现低丰度、高生物活性天然肽的方法，初步阐明了阿胶中天然肽的组成，并筛选出具有潜在降血压和降血糖双重效果的生物活性肽，从而为研究阿胶对血压和血糖调节作用的物质基础提供了基础数据。
章节摘要
试剂与材料
阿胶（国药集团中联药业有限公司；批号A1601–2401）；二硫苏糖醇（上海阿拉丁生化科技有限公司）；碘乙酰胺（上海阿拉丁生化科技有限公司）；质谱级乙腈（Thermo Fisher Scientific，美国）；三氟乙酸（上海麦克林生化科技有限公司）；碳酸氢铵（默克，德国）；以及纯净水（屈臣氏）。
仪器与设备
Easy-nLC 1200/Q Exactive液相色谱-质谱联用系统（Thermo
阿胶中天然肽的高覆盖度分析
利用NanoLC-MS/MS对阿胶中的天然肽进行分析，总离子色谱图如图1A所示。样品在检测期间信号响应较为稳定，肽在色谱梯度中分布良好。将质谱数据导入PEAKS Studio后，通过从头测序鉴定出4764条肽（补充表1）。为直观展示支持从头测序肽序列的谱图证据
讨论
高血压的病因病机较为复杂，主要以火证、水湿证和虚证为主要特征。其中，虚证主要与肾精不足和气血亏虚相关，常表现为肾虚和脾胃虚弱，其中肾虚尤为重要[43]。在中医中，糖尿病被归类为消渴病，是一种
结论
本研究利用从头测序技术系统鉴定了阿胶中的天然肽，并通过活性预测算法筛选出具有高活性得分的候选天然肽。进一步的计算机模拟分析表明，这些候选天然肽可能具有潜在的ACE和DPP-IV抑制活性。本研究为阐明阿胶药理作用的物质基础提供了初步证据。
作者贡献声明
张涵：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿撰写，可视化，方法学，调查研究，形式化分析，数据整理。李希旺：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿撰写，可视化，调查研究，数据整理。王思琦：撰写——审阅与编辑，验证，方法学，数据整理。张寿琪：撰写——审阅与编辑，验证，监督。罗刚：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取。高晓燕
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
张涵|李希旺|王思琦|张寿琪|罗刚|高晓燕
