《Journal of Chromatography B》：HPLC–FLD guided multimodal chromatographic isolation of pancreatic lipase modulators from
Saxifraga tangutica
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•HPLC-FLD实现了分离过程中胰脂肪酶亲和峰的识别与追踪。•胰脂肪酶亲和峰在反相和HILIC（亲水相互作用色谱）分离中保持可追踪性。•从唐古特虎耳草中分离得到三种化合物，包括1种激活剂和2种抑制剂。引言胰脂肪酶（PL）在膳食脂质消化中发挥核心作用[1]，负责约50%–70
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HPLC-FLD实现了分离过程中胰脂肪酶亲和峰的识别与追踪。
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胰脂肪酶亲和峰在反相和HILIC（亲水相互作用色谱）分离中保持可追踪性。
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从唐古特虎耳草中分离得到三种化合物，包括1种激活剂和2种抑制剂。
引言
胰脂肪酶（PL）在膳食脂质消化中发挥核心作用[1]，负责约50%–70%的膳食甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰甘油[2]、[3]。鉴于其在脂质消化中的重要作用，PL已成为调控膳食脂质吸收的重要靶点，特别是通过开发PL抑制剂的途径。奥利司他是一种成熟的胃肠道脂肪酶抑制剂，通过阻止膳食甘油三酯的水解来减少脂质吸收[4]。然而，其临床应用常伴随胃肠道不良反应，包括脂肪泻和油性便，并可能影响脂溶性维生素的吸收[5]。塞替司他是另一种用于治疗肥胖的胃肠道脂肪酶抑制剂，已获日本批准临床应用[6]。尽管取得了这些进展，临床可用的PL靶向小分子仍然有限，这表明仍有必要探索结构多样化的PL调节剂来源。在此背景下，天然产物因其广泛的结构多样性和生物活性，代表了酶靶向配体的宝贵化学储备库。越来越多的天然产物，包括黄酮类、多酚类、萜类、生物碱、皂苷和苷类，已被报道与PL相互作用或调节PL活性[7]、[8]。这些发现支持天然产物作为扩展PL亲和配体和调节剂化学及功能多样性的有前景的来源。
尽管天然产物作为酶调节剂来源具有潜力，但在复杂的天然产物中将生物活性与特定化合物联系起来仍然具有挑战性，因为大量共存成分在理化性质和丰度上差异显著，使得活性成分的定位和分离困难[9]。传统的生物活性导向分离依赖于反复的分级、活性评价和纯化来逐步缩小负责观察到的活性的成分范围[10]、[11]。然而，这种方法在整个分离过程中需要反复进行生物测定，耗时且样品量大。此外，在分级水平观察到的酶活性变化难以归因于与目标酶相互作用的具体化合物。在含有结构相似成分的复杂天然样品中，这一局限性尤为明显，缺乏可追踪的目标信息可能进一步增加后续分离纯化的难度。因此，建立酶亲和信息与特定色谱峰之间的直接联系，并将这些信息有效转移到后续制备分离中，对于提高从复杂天然产物中发现功能性酶配体的效率至关重要。
为提高从复杂天然产物中发现生物活性化合物的效率，亲和筛选作为一种在大规模分离前优先筛选潜在配体的方法应运而生。常见的亲和方法包括亲和超滤联用LC-MS、固定化酶配体钓取和亲和选择质谱，这些方法都利用选择性酶-配体相互作用从复杂混合物中鉴定候选化合物[12]、[13]、[14]。尽管这些方法能有效缩小潜在配体的范围，但所得信息仍主要停留在分析层面，仍需纯化化合物以进行确定的结构表征和功能评价。在此背景下，在线HPLC联用荧光检测（HPLC–FLD）通过将酶诱导的荧光响应与个体色谱峰直接关联，提供了亲和识别与靶向色谱分离之间的更紧密联系[15]、[16]、[17]。近期的应用已展示了其在复杂样品中定位PL亲和成分方面的实用性[18]、[19]。这种峰级归属使生物识别更接近色谱分离，但这些已定义的亲和峰如何转化为可追踪的靶向目标以实现选择性制备分离，仍然是关键的方法学挑战。
唐古特虎耳草（S. tangutica）是虎耳草科的一种植物，含有多种次生代谢产物，包括黄酮类、酚类、苯丙素类和双二芳基庚烷类[20]、[21]。然而，其作为PL亲和配体和功能性调节剂来源的潜力在很大程度上尚未被探索。为了更高效地探索这些成分，本研究建立了一种将亲和识别与连续靶向分离相结合的色谱工作流程（图1）。在此工作流程中，HPLC–FLD不仅用于初始亲和筛选，还用于在后续色谱分级和纯化过程中持续追踪预先定义的亲和峰。潜在PL亲和峰首先通过HPLC–FLD定位，随后在中压分级过程中进行追踪。对于富集馏分，通过比较反相和亲水相互作用色谱模式来提高对亲和峰的色谱选择性，并将优化后的亲水条件从分析级转移到制备级。这种持续追踪使得亲和峰在连续分离步骤中始终保持可识别性，并使分析阶段获得的亲和信息指导后续的色谱优化和靶向分离。分离得到的化合物随后进行了表征，并独立评估了其对PL活性的影响，同时通过密度泛函理论（DFT）计算和分子对接提供了互补的分子信息。
章节摘要
色谱试剂和仪器
HPLC级甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）和甲酸（FA）购自克伦化学有限公司（四川省成都市，中国）。纯化水（H2O）使用HyperPureX纯化系统制备（HyperPureX，上海，中国）。聚酰胺（100–200目）购自江苏淮安长风有机硅有限公司。MCI GEL CHP20P（120 μm）购自三菱株式会社（日本东京）。球形C18制备柱
唐古特虎耳草的色谱预处理和亲和谱分析
用MeOH提取500克唐古特虎耳草，得到65.0克粗提物，提取率为13.0%。随后将粗提物通过MCI GEL CHP20P柱进行在中压分级。如图2A所示，根据色谱图谱收集了6个馏分（Fr1-Fr6），其中Fr4用于后续亲和筛选。减压浓缩得到17.5克Fr4。这种初步分级减少了
结论
本研究建立了一种整合HPLC–FLD的多模态色谱策略，用于从唐古特虎耳草中发现PL调节剂。已通过将候选PL亲和响应与色谱峰关联，该策略实现了通过中压分级、选择性优化和分析到制备转移的连续靶向追踪，从而使得分析阶段获得的亲和信息能够指导后续的制备分离。三种
CRediT作者贡献声明
刘闯：初稿撰写、方法论、形式分析、数据管理。马建斌：初稿撰写、可视化、验证、方法论。赵勤：形式分析、数据管理。杜宇荣：验证、方法论。党军：审稿与编辑、监督、资金获取。
基金资助
本研究得到青海省科技厅成果转化专项项目（2024-SF-145）资助。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
刘闯|马建斌|赵勤|杜宇荣|党军
