屏障增强型透明质酸-胆红素纳米递送甲基强的松龙用于协同调节结肠炎中的肠道屏障、免疫系统和肠道微生物组

《Journal of Controlled Release》：Barrier-reinforcing hyaluronic acid-bilirubin nanodelivery of methylprednisolone for synergistic modulation of the intestinal barrier, immune system, and gut microbiome in colitis

摘要

炎症性肠病（IBD）的特征是肠道屏障功能障碍、肠道微生物群失调和异常黏膜免疫反应之间的自我强化循环。甲泼尼龙（MPS）是一种强效免疫抑制剂，用于IBD治疗，可能对肠道微生物群产生有益调节作用，但其全身性不良反应和潜在的 epithelial 修复损伤限制了其治疗应用。为克服这些局限，我们开发了负载MPS的透明质酸–胆红素纳米颗粒（MPS@HABN），这是一种口服纳米药物，旨在保护肠上皮免受MPS相关损伤，同时增强低剂量HABN所能实现的有限免疫和微生物群调节作用。MPS@HABN限制了药物的过早释放，增加了MPS在炎症结肠中的蓄积，降低了全身暴露和胸腺萎缩。它还保护了肠上皮细胞免受MPS相关和氧化性损伤。相比之下，低剂量HABN单独使用在免疫和微生物群调节方面效果有限，而游离MPS则导致肠道屏障损伤和全身性毒性，如胸腺萎缩。在DSS诱导的结肠炎模型中，MPS@HABN在增强免疫和微生物群调节的同时改善了肠道屏障功能，在低HABN剂量和临床相关MPS剂量下，其治疗效果超过了任一单独组分。这些发现支持将MPS和HABN的互补活性相结合，以克服糖皮质激素相关的上皮损伤和低剂量HABN的有限疗效，从而有助于打断结肠炎中病理性的屏障–免疫–微生物群循环。

引言

炎症性肠病（IBD）的发病机制仍未完全阐明。尽管如此，易患IBD的个体通常表现出肠道屏障功能障碍、肠道微生物群失调和针对失调微生物群的黏膜免疫反应异常的组合[1]、[2]、[3]。这些因素密切关联，形成一个自我强化的循环，加剧疾病病理过程[4]、[5]、[6]。然而，大多数现有疗法——无论是传统疗法还是靶向疗法——主要旨在抑制免疫过度激活，从而未能完全打断致病循环，可能使疾病严重程度恶化[7]、[8]、[9]。因此，开发能够同时解决这三个组分的治疗策略对于打断这一循环和释放重大治疗潜力至关重要[9]。

为应对这些挑战，我们此前开发了透明质酸–胆红素纳米颗粒（HABN），这是一种基于两亲性透明质酸–胆红素偶联物的口服纳米药物[10]。我们此前已证明，HABN通过CD44介导的与肠上皮细胞和巨噬细胞的相互作用，在炎症结肠组织中蓄积，改善肠道屏障完整性，调节失调的肠道微生物群，并在DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导的结肠炎模型中减轻黏膜炎症。尽管结果令人鼓舞，但实现HABN的多模式疗效需要相对较高的口服剂量（30 mg/kg），这对临床转化提出了重大挑战。这一担忧对IBD尤为重要，因为IBD是一种需要长期治疗的慢性疾病，持续高剂量可能引发安全性和耐受性问题。

值得注意的是，口服糖皮质激素，如甲泼尼龙（MPS），因其强效抗炎作用，被用于IBD的缓解诱导[11]、[12]。MPS已知可有效调节免疫反应[13]、[14]，并且根据一些研究，也可能对肠道微生物群产生有益影响[15]。虽然这些免疫调节和微生物群调节作用在IBD管理中很重要，但MPS可能对肠道屏障产生负面影响[16]、[17]、[18]、[19]，通过损害肠上皮和增加上皮通透性，进而可能加重疾病进展并阻碍IBD的成功缓解[20]、[21]。关键的是，由于IBD是一种需要长期治疗管理的慢性疾病[22]、[23]，MPS的长期使用受到极大限制，因为其全身性副作用——如胸腺萎缩、骨质疏松、肾上腺抑制、代谢并发症和感染易感性增加[24]。因此，虽然MPS可能提供暂时的缓解，但未能打断涉及肠道屏障、微生物群和免疫系统的病理循环，由于其严重副作用，不适合作为IBD的长期治疗。

为克服这些局限，我们开发了负载MPS的透明质酸–胆红素纳米颗粒（MPS@HABN），以保护肠上皮免受MPS相关损伤，同时增强低剂量HABN所能实现的有限免疫和微生物群调节作用（图1a）。这种MPS@HABN制剂能够在显著降低HABN用量（约为我们此前HABN单药治疗的十二分之一[10]）的同时递送临床相关的MPS剂量，从而增强疗效并大幅减少纳米颗粒负荷。HABN由两亲性透明质酸–胆红素偶联物形成，是一种口服纳米药物，通过HA外壳与CD44（表达于肠上皮和巨噬细胞[10]）之间的相互作用，选择性靶向炎症结肠组织——特别是肠上皮和巨噬细胞。此外，胆红素内核赋予活性氧（ROS）响应性药物释放功能，通过ROS诱导的溶解度从疏水到亲水的变化[25]、[26]、[27]，使MPS优先在ROS水平升高的炎症部位释放。在本研究中，我们证明利用MPS@HABN进行的ROS触发、结肠靶向递送显著减少了药物过早释放和全身暴露，同时产生来自释放的MPS和HABN纳米载体的协同治疗效果，作用于肠道屏障、肠道微生物群和免疫系统。在本研究中应用的低HABN剂量下，HABN单独仅产生屏障功能、免疫反应和微生物群组成方面的适度改善。相比之下，临床相关剂量下的MPS单药治疗导致显著的全身性毒性，恶化了屏障完整性，治疗效果甚微。MPS@HABN解决了这些互补性局限：HABN提供了针对MPS相关上皮损伤的保护，而MPS的纳入则增强了低HABN剂量下实现的免疫和微生物群调节作用。通过将上皮保护与增强的免疫和微生物群调控相结合，MPS@HABN实现了肠道屏障完整性、宿主免疫力和微生物生态学的协同改善，最终在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中取得了显著改善的疗效。

本研究首次证明，将甲泼尼龙（MPS）——一种已知会损害肠道屏障的糖皮质激素——封装在具有屏障保护、微生物群调节和免疫调节功能的纳米药物中，不仅能够减轻其固有的缺点，包括全身性毒性和屏障破坏，还能主动逆转这些效应。此外，我们表明MPS@HABN与我们先前的HABN制剂[10]不同，通过在低HABN剂量下进行屏障保护性纳米递送，恢复了临床相关但会损害屏障的糖皮质激素的治疗潜力，同时实现对肠道屏障、免疫反应和肠道微生物群的同时且协同的调节——这是任一单独组分无法实现的结果。综合来看，这些发现表明MPS@HABN提供了一种生物活性载体制剂策略，既解决了糖皮质激素治疗的递送局限和上皮不良反应，又改善了结肠炎中的屏障、免疫和微生物群相关结局。

首先，通过氨基乙基修饰的胆红素与透明质酸之间的酰胺键形成，利用标准EDC/NHS偶联化学合成了透明质酸–胆红素（HA–BR）偶联物（补充图1）。通过1H NMR分析确认了偶联的成功[10]。鉴于胆红素（BR）内核的高疏水性，我们假设疏水性甲泼尼龙（MPS）可以通过疏水相互作用有效地负载到形成的纳米颗粒（HABN）中。MPS的负载通过油包水（O/W）乳液法实现，随后进行透析（补充图2）。HPLC分析确认了MPS成功封装于HABN中，载药量为9.1% ± 0.5%，包封率为40% ± 3%。透射电子显微镜（TEM）显示负载MPS的HABN（MPS@HABN）形成了纳米结构（图1b）。

接下来，我们评估了HABN的ROS响应特性是否能在氧化条件下触发MPS从MPS@HABN中释放，同时在生理和胃肠条件下最大限度地减少脱靶释放。MPS@HABN在模拟胃液（SGF）、模拟肠液（SIF）或PBS中显示出可忽略的MPS释放或水力学尺寸变化，表明纳米颗粒在非氧化条件下保持稳定并有效防止了药物过早泄漏（图1c和图1d）。相比之下，暴露于AAPH[2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐，一种过氧自由基产生剂]时，MPS从纳米颗粒中快速释放，而在正常水溶液条件下释放可忽略不计，证实了该系统的ROS响应特性（图1e和补充图4）。

我们假设MPS@HABN将选择性靶向炎症结肠组织——特别是炎症上皮细胞和巨噬细胞——并减少MPS的全身暴露。为评估这一点，我们将ICG负载的HABN（ICG@HABN）或游离ICG口服给予DSS诱导的结肠炎小鼠和健康小鼠，并采集IVIS主要器官图像。如图2a所示，ICG@HABN选择性蓄积在DSS诱导的结肠炎小鼠的炎症结肠中，但未在健康小鼠的正常结肠中蓄积。相比之下，口服给予的游离ICG在炎症和健康结肠组织中均检测不到。此外，口服给予ICG@HABN后，主要全身器官中未观察到ICG信号，表明过早释放和全身分布极少。此外，口服给予MPS@HABN导致炎症结肠中MPS的蓄积量显著高于游离MPS，同时炎症结肠中的MPS蓄积量也高于正常结肠（图2b）。免疫荧光分析进一步证实，口服给予ICG@HABN后，ICG主要定位于炎症上皮和巨噬细胞内，与我们先前的发现一致（图2c和补充图4）。这些结果表明，HABN能够实现对有效载荷——如ICG或MPS——在炎症肠道部位的选择性递送，特别是炎症上皮和巨噬细胞，同时限制全身暴露。

接下来，我们检查了这种靶向递送是否能减少MPS的全身暴露和毒性。为此，小鼠口服给予游离MPS或MPS@HABN，并测量血清MPS水平以及胸腺-体重比。游离MPS治疗导致血清浓度显著升高和明显的胸腺萎缩，后者是糖皮质激素毒性的标志[28]。与之形成鲜明对比的是，MPS@HABN治疗导致全身MPS水平显著降低并保留了胸腺质量（图2d和图2e）。这些结果表明，将MPS负载到HABN中显著降低了与MPS相关的全身吸收和潜在全身性毒性。此外，体内安全性评估显示，MPS@HABN治疗后无明显毒性，表现为体重稳定、血参数正常，主要器官中未检测到组织学异常（补充图5）。综合来看，这些结果表明MPS@HABN在维持良好体内安全性的同时，最小化了全身MPS暴露和MPS相关毒性。

由于MPS@HABN选择性靶向巨噬细胞和肠上皮细胞，我们接下来调查了它是否能对这些细胞类型产生协同免疫调节作用。与游离MPS和单独HABN相比，MPS@HABN治疗显著降低了J774.A1巨噬细胞中促炎细胞因子的表达，同时增强了抗炎细胞因子的产生（图3a和补充图6）。重要的是，MPS@HABN在J774A.1巨噬细胞中未表现出细胞毒性，而游离MPS则引起了显著的巨噬细胞毒性（图3b和补充图6）。这些发现表明，虽然游离MPS的抗炎作用可能部分归因于细胞毒性引起的抑制，但MPS@HABN在不损害细胞活性的情况下实现了更优的抗炎疗效。

此外，我们调查了MPS@HABN是否能保护肠上皮细胞。选择HT-29和Caco-2细胞作为互补的肠上皮细胞模型，以评估MPS@HABN的保护作用是否在不同上皮细胞类型中一致观察到[29]、[30]。在有无过氧化氢（H2O2）的条件下，用游离MPS或MPS@HABN处理HT-29和Caco-2细胞，并测量细胞活力。如前所述[16]、[18]，游离MPS单独使用引起了轻度细胞毒性，并进一步加剧了上皮细胞中H2O2诱导的损伤（图3c-d和补充图7）。相比之下，MPS@HABN有效保护了HT-29和Caco-2细胞免受ROS介导的和MPS相关的细胞毒性（图3c-d和补充图7）。一致地，与氧化条件下游离MPS相比，MPS@HABN降低了细胞内ROS水平，进一步支持了HABN的细胞保护作用（图3c-d和补充图7）。值得注意的是，在LPS刺激的Caco-2细胞中，MPS@HABN协同增强了ZO-1和Occludin的相对mRNA表达水平，其效果显著大于MPS或单独HABN，后者分别仅引起轻微或中度的增加（图3e）。这些发现表明，MPS@HABN可以通过减轻氧化应激和糖皮质激素诱导的损伤来有效保护肠上皮细胞，同时协同增强上皮屏障完整性，超出单独MPS或HABN的作用。

近期研究强调了肠道微生物群在IBD治疗中的作用[31]，以及MPS和HABN对肠道微生物群调节的有益效果[9]、[10]、[15]。因此，我们通过V4区域的16S rRNA基因测序，对DSS诱导的结肠炎小鼠粪便样本进行了分析，检查MPS@HABN是否能协同改善微生物群失调和组成。与临床观察一致，与对照组相比，DSS诱导的结肠炎显著降低了细菌丰富度（观察到的操作分类单元（OTU）计数）和α多样性（Shannon和逆Simpson指数）（图4a和b）。

值得注意的是，MPS@HABN处理显著恢复了细菌丰富度和α多样性，而单独使用MPS或HABN仅显示出中等效果（图4a和b）。这些发现表明，MPS@HABN通过释放的MPS与HABN纳米载体的协同作用，改善了微生物组失调。非指标多维标度分析进一步表明，接受HABN治疗的DSS诱导性结肠炎小鼠的肠道微生物组图谱与其他治疗组有明显差异。在门、科和属水平的分类学分析显示，MPS@HABN显著增加了 Akkermansia muciniphila（与肠道屏障保护相关[32]、[33]）、Clostridium XIVα群（已知可诱导调节性T细胞[34]、[35]）和 Lactobacillus（以抗炎活性著称[36]、[37]）的相对丰度（图4d-g及补充图8）。这些有益菌群通常在炎症性肠病患者中减少，强调了MPS@HABN恢复这些菌群的治疗意义。相比之下，单独使用MPS或HABN仅对这些细菌种群产生极小或中等的变化。总之，这些结果表明MPS@HABN可能协同改善微生物组的失调和组成，从而有助于提高IBD治疗的疗效。近期研究表明，HABN具有内在的肠道屏障调节和免疫调节特性[10]，而MPS具有抗炎效果，但可能损伤肠道上皮[38]。因此，我们研究了MPS@HABN对DSS诱导性结肠炎中屏障功能受损的炎症性肠道上皮的影响。口服MPS@HABN显著增加了DSS诱导性结肠炎小鼠结肠中两种关键紧密连接标志物ZO-1和Occludin-1的mRNA表达，与DSS对照组和其他治疗组相比（图5a）。相比之下，HABN显示出中等活性，而单独使用MPS效果极小（图5a）。此外，在所有治疗组中，MPS@HABN治疗最有效地使口服给药后血液FITC-右旋糖酐水平正常化——这是肠道通透性的指标——该指标在DSS诱导性结肠炎小鼠中通常升高（图5b）。结合前述体外发现，即MPS@HABN可保护免受MPS和ROS引起的上皮损伤并增强ZO-1和Occludin表达，这些体内结果进一步证明MPS@HABN通过上皮保护和紧密连接强化直接增强了肠道屏障完整性。接下来，我们评估了MPS@HABN的免疫调节活性。如图5c和d所示，与其他对照组相比，MPS@HABN显著降低了DSS诱导小鼠结肠中促炎细胞因子（包括IL-1β、TNF-α和IL-6）的表达，同时上调了抗炎细胞因子IL-10的表达。相比之下，MPS和HABN在免疫消退方面表现出中等活性。此外，MPS@HABN治疗显著减少了DSS诱导性结肠炎小鼠固有层中促炎M1巨噬细胞（CD80+CD11b+F4/80+）的频率（图5e及补充图9），同时增加了抗炎M2巨噬细胞（CD206+CD11b+F4/80+）和调节性T细胞（CD3+CD4+Foxp3+）的频率（图5e-f及补充图9）。结合前述体外发现，即MPS@HABN可在不引起巨噬细胞细胞毒性的情况下有效调节细胞因子，这些体内结果进一步证明MPS@HABN通过抑制促炎反应同时促进抗炎巨噬细胞极化和调节性T细胞反应，直接重塑了炎症性免疫微环境。MPS@HABN对肠道屏障、肠道微生物组和免疫系统的协同靶向调节促使我们评估MPS@HABN在小鼠DSS诱导性结肠炎模型中的治疗疗效。为此，DSS诱导性结肠炎小鼠口服给予MPS、HABN、MPS@HABN或PBS（图6a）。鉴于高剂量HABN（约30 mg/kg）单独使用显示出强大的治疗效果，而MPS虽具有抗炎效果但可能损伤肠道上皮[16]、[39]，我们首先将HABN剂量降低至约十二分之一（2.5 mg/kg），这对于潜在的临床应用更为理想。对于MPS@HABN，我们进一步将MPS（0.25 mg/kg）以减少后HABN剂量（2.5 mg/kg）的十分之一比例纳入，这相当于MPS的临床相关剂量。口服MPS@HABN显著改善了体重减轻（图6b）并恢复了结肠长度（图6c）。此外，与其他治疗组相比，MPS@HABN治疗显著减少了炎症性结肠组织损伤、免疫细胞浸润和髓过氧化物酶（MPO）活性——一种关键促炎标志物（图6d-f）。相比之下，单独使用MPS和HABN显示出中等效果。值得注意的是，MPS@HABN还表现出优于5-氨基水杨酸（5-ASA）——一种IBD传统一线疗法——的治疗效果（图7）。这些发现表明，MPS@HABN通过MPS和HABN的共同作用，在DSS诱导性结肠炎小鼠中发挥强大且优越的治疗效果。尽管MPS@HABN的治疗活性可能与肠道屏障、肠道微生物组和免疫系统的同步调节有关，但仍需确定HABN对肠道微生物组的调节是否是其治疗效果的原因。为此，我们通过抗生素组合预处理制备了伪无菌小鼠（图8a），随后在饮用3% DSS水的小鼠中口服给予MPS@HABN或PBS。值得注意的是，抗生素预处理部分削弱了MPS@HABN的治疗效果，证明肠道微生物组调节在功能上贡献于而非仅仅伴随MPS@HABN的治疗效果（图8b-d）。有趣的是，即使在预处理了抗生素的DSS诱导性结肠炎小鼠中，MPS@HABN仍表现出中等的治疗活性，这与我们先前证明MPS@HABN可直接强化肠道屏障并调节炎症性免疫反应的体外和体内发现一致（图8b-d）。总之，这些发现证明，对肠道屏障、免疫系统和肠道微生物组的靶向调节是MPS@HABN治疗疗效的原因。抗生素预处理研究进一步支持了肠道微生物组的因果性贡献，而微生物组耗竭后的残余治疗活性则凸显了直接屏障强化和免疫调节的互补贡献。因此，这三种相互关联的机制协同打破了病理性的屏障-免疫-微生物组串扰，解释了MPS@HABN在DSS诱导性结肠炎中的强大治疗效果。章节片段透明质酸-胆红素偶联物（HA-BR）的合成为了提高透明质酸（HA）在DMSO等有机溶剂中的溶解度，通过将透明质酸钠盐（Lifecore Biomedical）在0.01 M HCl中透析过夜后进行冻干，制备了透明质酸的酸性形式。为获得氨基乙烯胆红素（AE-BR），将750 μmol胆红素（Lee Biosolutions）和520 μmol N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，Sigma-Aldrich）加入含有0.225 μl三乙胺（TEA）的7.5 ml二甲基亚砜（DMSO）中。讨论在本研究中，我们开发了MPS@HABN用于协同靶向调节肠道屏障、肠道微生物组和免疫系统，并证明了MPS@HABN在小鼠DSS诱导性结肠炎模型中的强大抗炎活性。尽管MPS单药治疗显示出抗炎效果，但它同时破坏了肠道屏障并引起严重的全身毒性，从而限制了其治疗潜力。值得注意的是，MPS@HABN通过减轻屏障损伤克服了这些局限性……作者贡献Y.L.和J.M.设计了实验。B.L.、Y.K.和J.Y.执行了大部分实验。H.-J.J.、X.C.和S.-E.K.参与了额外实验。Y.L.和J.M.分析了数据。Y.L.撰写了论文。CRediT作者贡献声明Bom Lee：可视化、验证、方法学、调查、形式分析。Jeeeun Yoo：可视化、验证、方法学、调查、数据整理。Hyeon-Jeong Jeon：调查。Yu Jeong Kim：调查。Xiaoliang Cheng：调查。Seong-Eun Kim：调查。James J. Moon：写作—审阅与编辑、监督、资源、项目管理。Yonghyun Lee：写作—审阅与编辑、写作—初稿、监督、项目管理、资金。利益冲突声明J.J.M.声明其作为EVOQ Therapeutics和Saros Therapeutics的董事会成员、付费顾问、研究资助和/或权益持有人存在财务利益。密歇根大学对EVOQ Therapeutics, Inc.有财务利益。致谢本研究得到了韩国教育部资助的国家研究基金会（NRF）基础研究计划（2022M3H4A1A03067401）的支持。本研究还得到了韩国保健福利部资助的韩国健康产业开发院（KHIDI）韩国健康技术研发项目资助（RS-2023-00265981）以及韩国基础科学研究所（国家研究设施与设备中心）的支持。Bom Lee | Jeeeun Yoo | Hyeon-Jeong Jeon | Yu Jeong Kim | Xiaoliang Cheng | Seong-Eun Kim | James J. Moon | Yonghyun Lee