《Journal of Controlled Release》：Terminal-overhang-restricted CRISPR logic nanodevice for precision cancer therapy
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摘要可控药物释放精度有限仍然是精准癌症治疗面临的一大挑战。本文整合APE1和miRNA-21作为双输入，开发了一种蛋白质和核酸双生物标志物响应的CRISPR AND逻辑纳米装置，称为LogiCas，用于精准的肿瘤治疗。利用Cas12a激活所需的严格构象匹配特性，LogiCas
摘要
可控药物释放精度有限仍然是精准癌症治疗面临的一大挑战。本文整合APE1和miRNA-21作为双输入，开发了一种蛋白质和核酸双生物标志物响应的CRISPR AND逻辑纳米装置，称为LogiCas，用于精准的肿瘤治疗。利用Cas12a激活所需的严格构象匹配特性，LogiCas借助分裂激活物的末端冗余限制建立了一种双锁、逐步激活机制，该机制包括APE1介导的预解锁和miRNA-21介导的终端激活，从而对Cas12a的反式切割实施严格门控控制。被激活的Cas12a进一步切割Ce6-BHQ3，触发Ce6介导的光动力疗法（PDT），产生活性氧（ROS），后者反过来驱动APE1从核到胞浆的转位，促成APE1介导的正反馈效应。在裸鼠模型中，LogiCas实现了肿瘤部位特异性药物释放，表现出强大的抗肿瘤效果，肿瘤抑制率约为91%，且无明显全身毒性。本工作提供了一种新设计策略，通过整合分子水平的蛋白质和核酸生物标志物，实现CRISPR介导的精准治疗激活。
引言
精准癌症治疗旨在根据肿瘤相关的生物信息定制治疗干预措施，以加强抗肿瘤反应并减少对正常组织的意外毒性，已成为癌症治疗的重要方向[1]、[2]。然而，大多数当前的治疗策略仍然面临肿瘤和正常组织之间选择性不足的问题，这持续限制了其治疗精度和应用安全性[3]、[4]、[5]。近年来，生物标志物响应治疗系统因其能够动态响应肿瘤中异常的生物信号（如核酸[6]、[7]，蛋白质[8]、[9]、[10]，小分子[11]和金属离子[12]）并选择性启动治疗输出，已成为提高治疗精度的前景策略。
基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的系统在构建生物标志物响应治疗平台方面展现了独特优势，这得益于其精确核酸识别、信号放大和可编程功能输出的整合能力[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。例如，先前的研究开发了miRNA响应的CRISPR系统，能够实现CRISPR相关蛋白9（Cas9）/单链向导RNA（sgRNA）复合物的细胞特异性释放，该复合物识别靶基因组序列并诱导DNA双链断裂，以实现可编程基因组编辑[19]。此外，Cas12a与CRISPR RNA（crRNA）联合用于识别线粒体DNA突变，并触发受控药物释放和光动力治疗输出[20]。然而，目前的基于CRISPR的策略主要局限于单一核酸输入[19]、[20]。这些单一输入的内在异质性和模拟性质往往导致非预期的背景激活，从而降低治疗精度[21]。
与依赖单一类别生物标志物的传统策略[22]、[23]、[24]相比，逻辑整合蛋白质和核酸生物标志物能够实现多维度的细胞表征，从而显著增强药物释放精度[25]、[26]、[27]。例如，无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶1（APE1）是碱基切除修复中的关键内切核酸酶，能够切割无碱基（AP）位点[28]、[29]，在多种肿瘤中表现出异常表达和核到胞浆的转位[30]、[31]。同时，miRNA-21作为一种经典的致癌性miRNA，在各种肿瘤细胞中持续过表达，并参与细胞增殖、迁移和抗凋亡过程[32]、[33]、[34]。然而，目前的CRISPR治疗系统仍缺乏一种能够同时整合这两种分子水平输入并高效地将它们的协同识别转化为治疗输出的策略。
在此，我们构建了一种蛋白质/核酸双生物标志物响应的CRISPR AND逻辑纳米装置，称为LogiCas，它将蛋白质生物标志物APE1和核酸生物标志物miRNA-21作为协同输入信号进行处理（图1）。通过利用Cas12a分裂激活物的5'末端冗余限制[35]、[36]、[37]、[38]，LogiCas建立了一种双锁架构，将APE1介导的预解锁与miRNA-21介导的终端激活相耦合，从而实现蛋白质-核酸跨类型AND门对Cas12a反式切割的控制。门控Cas12a激活进一步与BHQ3淬灭的卟啉e6（Ce6-Q）的去淬灭相耦合，其中BHQ3笼式抑制Ce6的光动力活性，直到Cas12a介导的切割发生，从而将双生物标志物识别转化为光动力治疗输出。值得注意的是，光动力治疗过程中产生的ROS促进APE1从核到胞浆的转位，这进一步促进系统激活，从而建立了一个前馈放大过程，增强了治疗反应。因此，LogiCas整合了双生物标志物识别、顺序CRISPR逻辑门控和治疗放大，用于生物标志物引导的癌症治疗。
章节摘要
核酸制备
本工作中使用的寡核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司（上海，中国）合成，详细序列见表S1。除非另有说明，crRNA通过使用含有T7启动子和相应crRNA序列的DNA模板进行体外转录制备。在Cas12a crRNA支架中掺入了20 nt的5'末端延伸，以实现Cas12a/crRNA的杂交介导装载
通过5'末端分子锁构建AND门控Cas12a系统
虽然CRISPR系统擅长可编程核酸识别[38]、[41]、[42]，但使其在体内对蛋白质生物标志物做出响应仍具有挑战性。在此，我们利用分裂核酸激活物设计了一种双片段Cas12a调控架构[35]、[36]，将一个片段用于核酸感知，另一个作为拓扑调控域。考虑到有效的Cas12a激活需要分裂激活物的精确构象匹配[37]，我们
结论
总之，本工作开发了LogiCas，一种蛋白质/核酸双生物标志物响应的CRISPR AND逻辑纳米装置，旨在通过APE1和miRNA-21双输入门控将肿瘤相关分子信号转化为精准的治疗输出。与现有主要仅依赖核酸输入的CRISPR治疗策略不同，本研究进一步利用了Cas12a分裂激活物的5'末端冗余限制，建立了一种双锁、逐步激活机制
CRediT作者贡献声明
张敬格：写作—审阅与编辑，写作—原稿撰写，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念构思。杨宇河：写作—审阅与编辑，写作—原稿撰写，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念构思。吴勇华：写作—审阅与编辑，方法论，数据整理。石梦媛：方法论，调查。谭新宇：写作—审阅与编辑，形式分析。张程智：形式分析，数据
利益冲突声明
作者声明他们没有已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（编号：U23A20531、22377110、22122409）资助KX.Z.、ZZ.Z.和YN.L.；河南省自然科学基金（编号：252300421073）；代谢紊乱国家实验室及食管癌防治实验室（编号：2025SGAQZ-MS-03）；河南省重点研发计划（编号：261111313300）；以及河南省科学技术协会（编号：2026HYTP020）的资金支持。本工作
张敬格|杨宇河|吴勇华|石梦媛|谭新宇|张程智|倪倩倩|王金金|张震中|李亚楠|张开香
