肺表面活性剂增强脂质纳米颗粒用于肺部mRNA递送：Poractant-α改善颗粒组装、表观pKa与内体逃逸

《Journal of Controlled Release》：Lung surfactants as a component of lipid nanoparticles for pulmonary mRNA delivery

肺部脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）递送仍是一个重要关注领域，因为通过将治疗性核酸局部递送至肺部，可解决广泛的遗传性疾病。在本研究中，研究人员探讨了将临床使用的肺表面活性剂混合物 Poractant alfa 掺入负载 mRNA 的 LNPs 后，对其体外和体内转染性能的影响。所得肺表面活性剂增强型 LNPs（Surf-LNPs）在颗粒组装方面表现出显著改善，在相同输入条件下相较传统（Onpattro样）LNP制剂，颗粒浓度提高约1个数量级。体外实验中，Surf-LNPs 的 mRNA 转染效率和蛋白表达提高数倍，同时保持优异的细胞相容性。这些增强归因于表观 pK_a 升高以及表面活性蛋白 B（surfactant protein B, SP-B）的表面活性，从而相较传统 LNPs 促进更快、更高效的内体逃逸。鼻内给药后的体内评估进一步显示，与常规 LNPs 相比，经 Surf-LNPs 处理的小鼠肺部 mCherry 表达增强。最终，这些发现确立将肺表面活性剂掺入作为一种简单而有力的制剂策略，以改善使用 LNPs 的肺部基因递送，并具有显著推进吸入式核酸治疗药物转化的潜力。

Sarah S. Nasr 等研究人员研究了肺表面活性剂作为脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）组分用于肺部 mRNA（messenger RNA，信使RNA）递送，论文发表于《Journal of Controlled Release》。LNPs 已成为核酸递送的一流制剂，可电离脂质广泛用于治疗性 mRNA 递送，且 LNP 可通过组分调节细胞摄取和器官靶向。但肺部 LNPs 递送面临鼻内和吸入途径炎症潜力等挑战；既往策略包括设计促进肺上皮转染的新可电离脂质、提高 PEG 化脂质比例、优化 LNP 组成或缓冲液、加入稳定辅料、掺入细胞穿透肽等，但仍需克服气道黏液屏障并将 mRNA 递送至疾病相关细胞，提高摄取和内体逃逸可抵消高 PEG 化造成的效率下降。II 型肺泡上皮细胞产生的肺表面活性剂既被认为可增强肺部纳米颗粒递送，也被视为递送屏障。基于肺表面活性剂与常规 LNP 组分尤其辅助脂质和胆固醇的结构相似性，研究人员假设可制备适合肺部基因治疗的有效肺表面活性剂基 LNPs。为此，研究人员用 Poractant-α（猪肺表面活性剂混合物）替换 DSPC（distearoylphosphatidylcholine，二硬脂酰磷脂酰胆碱）。Poractant-α 是治疗早产儿呼吸窘迫综合征（respiratory distress syndrome, RDS）的天然肺表面活性剂，含生理相关磷脂和脂蛋白；DPPC（dipalmitoyl phosphatidylcholine，二棕榈酰磷脂酰胆碱）是其主要有磷脂，与 DSPC 相似，仅 DPPC 为 C16、DSPC 为 C18 饱和磷脂。Surf-LNPs 其余组分为 Dlin-MC3-DMA 50%、胆固醇 38.5%、DSPE-PEG₂₀₀₀K 1.5%，N/P比 6。研究意义是确立肺表面活性剂掺入为简单有力策略改善肺部基因递送，推进吸入核酸治疗转化。

关键技术方法概述（≤250字）：研究人员以 Dlin-MC3-DMA、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀K 及 DSPC 或 Poractant-α 制备 LNP 与 Surf-LNP，负载 mEGFP、mCherry 或荧光素酶 mRNA。采用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）表征粒径、ζ电位和颗粒浓度，Ribogreen 法测包封效率，Gamble's 溶液评估模拟肺液稳定性。黏液来源于 BCi-NS1.1 人气道上皮细胞（human airway epithelial, HAE）气液界面（air-liquid interface, ALI）培养；用多颗粒追踪（multiple particle tracking, MPT）评估黏液扩散。体外使用 A549 与 BCi-NS1 细胞评估转染，LysoTracker 共定位分析内体逃逸。体内使用 8 周龄雌性 BALB-c 小鼠鼻内或气管内给药，经荧光显微镜、流式细胞术、ELISA 和 IVIS 评估表达、细胞类型、炎症与生物分布。

研究结果：
3.1 肺表面活性剂对 LNP 配方的影响：DLS/NTA 显示 Surf-LNPs 粒径略小且有统计学意义，二者多分散指数（PDI）分别为 0.24±0.06 和 0.24±0.01；均净正 ζ电位，但 Surf-LNP 表面电荷降低约10 mV。相同有效 mRNA/脂质浓度下，Surf-LNPs 颗粒数比传统 LNPs 高约1个数量级，包封效率相当且可接受。研究人员认为颗粒数增加可能归因于表面活性蛋白结构，如 SP-B 正电荷（+5至+8）促进 mRNA 结合和快速压缩；SP-B、SP-C 含碱性氨基酸，生理 pH 下带净正电荷。SP-B 主要掺入模式仍需未来计算和生物分子分析确定。

3.2 LNPs 与 Surf-LNPs 的稳定性及黏液穿透能力：Gamble's 溶液孵育4 h，Surf-LNP 保持高一个数量级总颗粒浓度，但表观胶体稳定性较低，颗粒数减少 32.7±3.3%，LNP 减少 23.1±10.4%。用 BCi-NS1.1 ALI 培养黏液、DiD 标记颗粒、共聚焦视频和 MPT 评估，二者高度扩散，可能因 DSPE-PEG 屏蔽；无显著差异，Surf-LNP 稍向高均方位移（MSD）偏移。多数颗粒（>50%）在 τ=1 s 时 MSD ≥1 μm²。

3.3 体外转染效率的比较评估：A549 和 BCi-NS1 细胞中，mRNA 剂量 1 μg/孔、24 h。A549 中 Surf-LNPs 转染效率约提高8.5倍，蛋白表达约提高7倍；BCi-NS1 中转染效率约提高6.5倍，蛋白表达提高4个数量级；细胞活力可接受，Surf-LNP 略高但无统计显著。研究人员认为颗粒组装改善和更高颗粒数可能有助于体外转染，Poractant-α 及脂蛋白组分的内体逃逸增强也可能起作用。

3.4 Surf-LNP 的表观 pK_a 与内体逃逸动力学：LysoTracker 成像显示 DiD 标记 Surf-LNPs 比 LNP 摄取更高、更早。2 h 时 Surf-LNPs 显著摄取并均匀分布于细胞质，内体腔难染色，可能早期高效逃逸；LNP 摄取较低且局部，2 h 可染内体，表明摄取和内体逃逸较慢。6 h 时 LNP 摄取增加，但内体 LNP 仍高于 Surf-LNP。表观 pK_a：LNP 6.3，Surf-LNP 6.8，与更早内体逃逸一致。机制可能包括高表观 pK_a 促进与内体膜融合并转化六角相、SP-B 形成通道或纳米孔、经直接或反向融合逃逸。

3.5 鼻内给药后 LNP 与 Surf-LNP 的体内性能：8 周龄雌性 BALB-c 小鼠鼻内给 DPBS（n=2）、LNP（n=5）或 Surf-LNP（n=5），mCherry mRNA 2.5 μg，剂量 0.125 mg/kg，20 μL，6 或 24 h 后处死。共聚焦显示 Surf-LNP 气管衬里 mCherry 表达高于 LNP；肺实质类似且显著高于 LNP，主要在细支气管周围。24 h 全肺匀浆 Surf-LNP 组 mCherry 显著高于未处理，LNP 变异大且与 PBS 或 Surf-LNP 无显著差异。流式显示 LNP 转染 EPCAM⁺ 和 CD45⁺ 细胞，Surf-LNP 主要转染 EPCAM⁺ 细胞。6 h 后 LNP 或 Surf-LNP 均未显著增加 TNF-α、IL-1?、IL-6 相较 PBS。气管内给予 5 μg 荧光素酶 mRNA 后 6 h IVIS 评估，Surf-LNP 肺内发光有轻微升高趋势但无统计显著增加。

讨论与结论翻译：讨论部分总结：Surf-LNP 增强可能来自更高表观 pK_a 和 SP-B 表面活性，促进更早更快内体逃逸；SP-B 可诱导负膜曲率、形成通道或纳米孔，并通过直接融合或反向融合促进 mRNA 逃逸。局限是导致性能增强的具体组分尚未最终确定，未来需系统比较单个肺表面活性剂组分制备的 LNP；吸入递送需与振动网雾化器和/或吸入器兼容，保持液体和/或干粉气溶胶稳定性。结论翻译：研究人员证明，将商业 LNP 的标准辅助脂质 DSPC 替换为商业可用肺表面活性剂 Poractant-α，因改善颗粒组装使颗粒数呈对数增加，可能归因于 SP-B 等表面活性蛋白独特的 saposin 样结构促进更紧凑高效包装。所得 Surf-LNP 显示更早和更高的内体逃逸，可能由于 SP-B 等表面活性脂蛋白掺入以及 Surf-LNP 更高表观 pK_a。由于内体逃逸增强，Surf-LNP 在转染效率和蛋白表达水平上显著优于传统 LNP。研究发现强调，将肺表面活性剂来源组分掺入 LNPs 可主动促进内体逃逸，从而增强性能。研究人员还观察到鼻内递送 Surf-LNP 后体内 mRNA 表达相较 LNP 提高约2倍，转染谱明显偏向上皮细胞而非免疫细胞。因此，Surf-LNP 值得进一步研究用于蛋白替代治疗，特别是靶向上皮细胞亚群。然而，该工作局限是导致肺表面活性剂介导 LNP 性能增强的具体组分尚未最终确定，未来需系统比较由单个肺表面活性剂组分制备的 LNP。对于吸入递送，需确保制剂与临床设备如振动网雾化器和/或吸入器兼容，Surf-LNP 分别需保持液体和/或干粉气溶胶稳定性。鉴于该方法可用于多种新兴 LNP 配方，研究人员计划将这一制剂策略与其他可电离脂质平台结合，以进一步改善慢性肺病肺部 mRNA 治疗。