仙寿粥通过促进谷胱甘肽代谢并抑制铁死亡通路改善自然衰老大鼠认知障碍的代谢组学研究

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Metabolomics Analysis Revealed That SXZ Ameliorates Cognitive Impairment in Naturally Aged Rats by Promoting Glutathione Metabolism and Inhibiting the Ferroptosis Pathway

目的：本研究旨在探讨仙寿粥（SXZ）对自然衰老大鼠认知障碍的潜在神经保护作用，并探索其潜在分子机制。 方法：采用18月龄Sprague–Dawley大鼠作为自然衰老模型，给予仙寿粥（SXZ）干预6个月。通过行为学评估检测认知功能；采用苏木精–伊红（HE）染色、尼氏（Nissl）染色及NeuN免疫荧光染色评估衰老大鼠的神经元病理改变；开展代谢组学（Metabolomics）分析以表征海马代谢物特征，随后进行分子验证。 结果：仙寿粥（SXZ）减轻了自然衰老大鼠的年龄相关认知衰退，并减少了海马病理及神经元损伤。高剂量仙寿粥（SXZ-H）显著调节了谷胱甘肽代谢及铁死亡（Ferroptosis）相关信号通路。透射电子显微镜（TEM）观察显示，自然衰老大鼠海马神经元出现与铁死亡一致的线粒体形态改变。分子生物学实验进一步表明，经SXZ-H干预后，脂质过氧化及氧化应激水平显著降低。此外，p53与Keap1基因及蛋白表达水平显著下调，而SLC7A11、GPX4、Nrf2及HO-1基因和蛋白表达显著上调。 结论：高剂量仙寿粥（SXZ-H）有效缓解自然衰老大鼠的认知障碍，其效应可能通过促进谷胱甘肽代谢并调控铁死亡关键相关蛋白，从而抑制神经元铁死亡来实现。

一、研究背景与问题

衰老是机体组织器官功能进行性衰退的自然生物学过程。随着全球人口老龄化加剧，年龄相关疾病的发生风险显著升高。衰老损害学习记忆功能并导致认知能力下降，流行病学研究表明65岁以上人群中约10%–20%存在认知衰退，这大大增加了痴呆及其他神经系统疾病的患病风险。年龄相关的认知障碍也给家庭和社会带来沉重负担。目前针对年龄相关认知障碍的药物治疗手段有限且效果常不理想，系统评价显示乙酰胆碱酯酶抑制剂和美金刚（Memantine）在预防轻度认知障碍患者痴呆方面获益有限，且可能引起不良反应。因此，亟需更安全有效的治疗策略。

中药（TCM）在年龄相关认知障碍的临床治疗中具有悠久历史。仙寿粥（SXZ）首载于敦煌遗书P.3810《呼吸静功妙诀》，由大米、山药、韭子、芡实四味组成。既往研究证实仙寿粥具有抗衰老作用，并对X射线诱导的大鼠脑损伤具有显著神经保护活性。然而，仙寿粥治疗年龄相关认知障碍的疗效及潜在机制尚不明确。代谢组学（Metabolomics）作为组学研究的分支，可系统分析生物体内小分子代谢物的动态变化，在阐明年龄相关认知障碍机制方面具有独特优势。目前尚无研究运用代谢组学方法探讨仙寿粥缓解衰老相关认知衰退的分子机制。

二、研究内容与结论

本研究采用18月龄雌性Sprague–Dawley大鼠作为自然衰老模型，以更真实地模拟衰老过程。经模型验证后，将12只2月龄大鼠设为对照组（Control），48只18月龄大鼠随机分为模型组（Model）、仙寿粥高剂量组（SXZ-H，20 g/kg）、中剂量组（SXZ-M，10 g/kg）和低剂量组（SXZ-L，5 g/kg），连续灌胃干预6个月。行为学测试表明，仙寿粥剂量依赖性地改善了自然衰老大鼠的认知功能，其中高剂量组效果最为显著。组织病理学检测显示，SXZ-H减轻了海马病理损伤，增加了NeuN阳性神经元和尼氏小体数量，对海马神经元发挥保护作用。基于高剂量的最优效果，研究人员选择SXZ-H组开展后续机制研究。

三、主要关键技术方法

研究人员采用高效液相色谱–串联质谱（HPLC-MS/MS）技术鉴定仙寿粥入血活性成分；运用Y迷宫和Morris水迷宫（MWM）评估大鼠空间学习记忆能力；通过苏木精–伊红（HE）染色、尼氏染色和NeuN免疫荧光染色评估海马神经元病理；采用非靶向代谢组学（Untargeted metabolomics）分析海马代谢物谱，数据已存入MetaboLights数据库（编号MTBLS15736）；运用透射电子显微镜（TEM）观察线粒体形态；通过免疫荧光、RT-qPCR和Western blot（WB）检测关键蛋白和基因表达；采用比色法试剂盒检测Fe²⁺、SOD、MDA、LPO、GSH、GSSG、GSH-Px、NADP⁺/NADPH等指标。样本来源于甘肃中医药大学提供的雌性Sprague–Dawley大鼠。

四、研究结果

3.1 仙寿粥血清活性成分分析：质谱分析鉴定出90种入血成分，包括脂质、类固醇及其衍生物、有机酸及其衍生物和黄酮类等。按相对峰面积，排名前10的活性成分为Pc(34:2)、千层纸素A（Oroxylin A）、汉黄芩素（Wogonin）、高良姜素3-甲醚、3-(3,4-二羟基苯基)丙酸甲酯、巴德苷（Paederoside）、木蝴蝶苷（Oroxyloside）、毛蕊花糖苷（Verbasoside）、桔皮素（Sinensetin）和2-甲基-6-苯基-4H-吡喃-4-酮。

3.2 仙寿粥对自然衰老大鼠年龄相关认知障碍的保护作用：Y迷宫测试显示，模型组大鼠自发交替率显著降低，经SXZ-H和SXZ-M治疗6个月后显著恢复。Morris水迷宫测试中，第5天模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，SXZ-H组寻找隐藏平台时间显著缩短；第6天探索实验中，模型组平台穿越次数和目标象限停留时间显著减少，SXZ-H组两项指标均显著增加。结果表明仙寿粥增强自然衰老大鼠的空间认知能力，其中SXZ-H效果最显著。

3.3 SXZ-H对自然衰老大鼠海马组织病理学的影响：HE染色显示模型组细胞排列松散紊乱，部分细胞肿胀、胞浆深染、核固缩，SXZ-H治疗后这些病理改变减轻。NeuN免疫荧光染色显示模型组NeuN阳性神经元显著减少，SXZ-H治疗显著缓解这一下降。尼氏染色显示模型组海马神经元排列稀疏、边界不清，尼氏阳性神经元数量显著减少，SXZ-H治疗后显著改善。

3.4 SXZ-H对年龄相关认知障碍大鼠海马代谢谱的影响：OPLS-DA得分图显示各组间显著分离，自然衰老显著影响海马内源性代谢物，SXZ-H干预6个月后表现出显著调节作用。KEGG富集和Z-score分析表明差异代谢物显著富集于花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸合成和谷胱甘肽代谢等与脂质过氧化和氧化还原调节相关的通路。相对丰度可视化显示，SXZ-H治疗后谷胱甘肽亚精胺（Glutathionylspermine）和辅酶Q₁₀（Coenzyme Q₁₀）上调，其中谷胱甘肽亚精胺显著增加；Fe²⁺、谷胱甘肽亚精胺前体（Glutathionylspermidine）、甲羟戊酸、L-谷氨酸、α-生育酚、铁、NADP⁺和L-鸟氨酸等8种代谢物下调，其中Fe²⁺、谷胱甘肽亚精胺前体、铁、L-鸟氨酸、甲羟戊酸和NADP⁺显著降低。

3.5 SXZ-H对自然衰老大鼠海马铁死亡相关指标的影响：透射电镜显示模型组海马神经元线粒体出现铁死亡特征性改变，包括线粒体萎缩、双层膜密度增高、嵴减少，SXZ-H治疗显著改善这些异常。模型组4-HNE、Fe²⁺、LPO、MDA、ROS水平及NADP⁺/NADPH比值显著升高，GSH-Px、SOD活性和GSH/GSSG比值显著降低；SXZ-H治疗6个月后除Fe²⁺外各指标均显著改善。

3.6 SXZ-H对p53/SLC7A11/GPX4通路关键分子表达的影响：免疫荧光显示模型组海马p53水平显著升高，SLC7A11和GPX4表达显著降低，SXZ-H治疗6个月后恢复其表达。RT-qPCR和WB结果一致印证了相同表达趋势。

3.7 SXZ-H对Keap1/Nrf2/HO-1通路关键分子表达的影响：免疫荧光显示模型组海马Keap1水平显著升高，Nrf2和HO-1表达显著降低，SXZ-H治疗6个月后恢复其表达。RT-qPCR和WB结果一致印证了相同表达趋势。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究采用18月龄雌性大鼠作为自然衰老模型，较D-半乳糖诱导模型更能模拟衰老的慢性适应过程。仙寿粥的活性成分如千层纸素A、汉黄芩素和毛蕊花糖苷等已被证实具有促进神经发生、改善学习记忆和减轻脑损伤的作用。代谢组学分析表明仙寿粥的神经保护作用主要与谷胱甘肽代谢和铁死亡通路相关。自然衰老诱导海马脂质过氧化导致铁死亡发生，而SXZ-H通过增强抗氧化防御和减少脂质过氧化底物两条途径有效抑制铁死亡并改善认知功能，且不直接改变游离Fe²⁺浓度。机制上，SXZ-H通过抑制p53激活并恢复SLC7A11和GPX4表达来拮抗铁死亡，同时通过促进Nrf2表达、降低其负调控因子Keap1水平、恢复HO-1和SOD活性来缓解氧化应激。

研究结论为：仙寿粥改善自然衰老大鼠的认知障碍，表现为行为表现和海马组织病理形态的改善。机制上，SXZ-H通过调控p53/SLC7A11/GPX4和Keap1/Nrf2/HO-1信号通路抑制海马铁死亡。这些发现提示SXZ-H可能通过调节相关通路对抗年龄相关认知障碍，为衰老相关认知衰退的临床治疗提供新的治疗靶点和干预策略。