将高分辨率近邻标记技术与正交相互作用组基准测试相结合：来自运动体系统的见解

《Journal of Proteomics》：Integrating high-resolution proximity labelling with orthogonal interactome benchmarks: Insights from Kinetoplastid systems

　　•邻近标记技术越来越多地与正交互作组学工作流程相结合。•SEC-MS和XL-MS为验证基于邻近关系的相互作用提供了互补的框架。•AlphaFold 3和人工智能驱动的模型增强了互作组学数据集的结构解释能力。•基于CRISPR的内源性标记技术支持动质体中的高可信度空间蛋白质组学研究。•动质体为评估下一代互作组学技术提供了有价值的模型。

1. 引言
蛋白质相互作用伙伴的鉴定通常被认为是阐明分子功能和细胞过程的重要步骤。一种广泛使用的策略是先通过亲和纯化目标蛋白，然后利用质谱技术（AP-MS）检测共纯化的蛋白[1]。尽管AP-MS是一种成熟的方法，但成功实施该方法需要仔细优化裂解条件，以确保诱饵蛋白的有效溶解，同时避免引入可能破坏诱饵-靶标相互作用的过度严格性。维持这些相互作用需要相对温和的裂解和洗涤条件；然而，这样的条件也可能导致在体内不会发生的非生理性裂解后相互作用[2]。邻近标记是一种基于感兴趣蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用网络的成熟探针技术，消除了在细胞裂解和富集步骤中保持天然相互作用的需要[3]。其主要优势在于将感兴趣的蛋白质与一种能够在体内共价标记邻近蛋白质的酶融合表达[4]。在标记过程中，相互作用的蛋白质会不断结合和分离，从而可能随着时间的推移积累生物素化信号，而AP-MS只能在裂解时刻捕捉蛋白质-蛋白质相互作用。同样，双杂交相互作用系统（如酵母双杂交）有助于高通量识别直接蛋白质相互作用体；然而，它们通常依赖于异源表达系统，可能不能完全反映天然生物学背景[5],[6]。
随着基于邻近关系的生物素化技术的出现，蛋白质-蛋白质相互作用和亚细胞蛋白质组的鉴定发生了深刻的变化。自从基于生物素连接酶BirA的变体BirA*开发的BioID以来，邻近标记工具箱已经得到了显著改进，以满足高分辨率蛋白质组学的严格要求。从第一代连接酶到更快工程化的变体（如TurboID和miniTurbo）的转变大大缩短了标记时间，从数小时缩短到几分钟，从而减轻了在高动态环境中的空间模糊现象[3],[8],[9]。近年，下一代紧凑型连接酶的发展进一步扩展了邻近标记在空间蛋白质组学中的应用[10],[11],[12]。虽然这些成熟的邻近标记方法现在已在哺乳动物系统中常规使用，但将其应用于动质体（特别是Leishmania、Trypanosoma brucei和Trypanosoma cruzi）时，会遇到特定的物种或阶段相关的生物学和技术限制，包括非传统的多基因表达调控、特殊的氧化还原生物学以及密集的细胞骨架结构[13],[14]。
本综述查阅的文献通过PubMed、Web of Science和Scopus检索获得，优先考虑了涵盖邻近标记、动质体互作组学、互补蛋白质组学和结构方法及其计算解释的原始研究和相关方法学或综述研究，并更新至2026年9月6日。
动质体研究中的一个主要瓶颈仍然是暗蛋白组（即未通过实验验证的蛋白质组）的特征鉴定。最近的全基因组和小基因组研究表明，Leishmania donovani中的大约8400个基因中有超过60%编码的蛋白质与已知的真核生物蛋白质缺乏显著的序列同源性，因此仍被归类为假想蛋白质[15],[16]。填补这一重大知识空白依赖于将基于邻近关系的数据集与独立的蛋白质组规模参考资源相结合的综合性策略。早期的蛋白质组学研究已经认识到，只有约30-35%的Leishmania蛋白质组得到了实验验证，这突显了需要更全面的蛋白质组学技术来扩大蛋白质组覆盖范围和功能注释[17]。随后对L. donovani蛋白质组的蛋白质基因组重新分析将实验验证的蛋白质组覆盖范围增加到近3999个蛋白质（约占预测蛋白质组的50%），同时通过发现新基因和修正现有基因模型改进了基因组注释。这些发展为下游的功能注释和基于互作组的研究提供了显著改进的参考蛋白质组[18]。此外，最近在多种Leishmania物种上进行的大规模定量蛋白质组学分析记录了寄生虫蛋白质组在生长阶段转换和温度压力下的广泛物种特异性和环境驱动的重塑。这种广泛的重塑强调了寄生虫蛋白质组在环境条件下的显著可塑性。这些发现表明，蛋白质的丰度和组成高度依赖于具体环境，暗示仅依靠全蛋白质组丰度测量可能不足以解决蛋白质在生理相关条件下的功能分子邻域组织问题[19]。空间蛋白质组学可以通过捕获关于蛋白质在细胞区室中分布和组织的信息来克服这一限制，从而能够超越单纯的全局丰度测量所提供的信息，定义出空间上明确的分子邻域[6]。
在动质体中，一个关键挑战不仅在于简单地绘制蛋白质关联图谱，还在于阐明蛋白质组织如何在不同发育阶段、亚细胞区室和特定寄生虫细胞结构中变化。这一点尤为重要，因为动质体寄生虫在保持高度特化的细胞结构（如动质体、鞭毛和鞭毛囊）的同时，会经历广泛的阶段依赖性蛋白质组重塑。例如，在Trypanosoma brucei中，鞭毛囊是一个特殊的膜结构，是内吞和外吞作用的唯一场所，而鞭毛则表现出与特殊细胞骨架结构相关的空间不同分子亚域[14],[20]。这种空间组织引发了生物学问题，即在这种情况下，邻近关系而非单纯的蛋白质丰度对于表征功能分子邻域至关重要。在这方面，邻近标记在动质体中的实用性不仅限于作为传统互作组学方法的通用替代方案，而且能够表征那些用大规模蛋白质组学或亲和方法难以检测的空间和时间受限的蛋白质关联。使用尺寸排阻色谱-质谱（SEC-MS）和交联质谱（XL-MS）生成的L. donovani [21]和T. cruzi [22]的全面物理互作组图谱，为精炼邻近标记数据集和区分真实复合物与背景随机相互作用提供了可靠的参考基准[23]。
最近的研究扩展了对动质体寄生虫在蛋白质水平上的认识。具体来说，Nepomuceno-Mejía等人最近利用串联亲和纯化结合质谱技术，鉴定了Trypanosoma brucei和Leishmania major中Nop7相关的蛋白质相互作用网络，揭示了保守的核糖体生物发生因子和潜在治疗靶点[24]。同时，对Trypanosoma cruzi的细胞内和无性变形体形式的定量鸟枪法蛋白质组学分析提供了在复制和非复制条件下的全面蛋白质组级特征描述，强调了能量和氨基酸代谢、蛋白质翻译、细胞周期调控、泛素化和动质体DNA维持方面的阶段相关差异[25]。总体而言，这些研究展示了可用于动质体寄生虫的互作组和蛋白质组资源的不断扩展，并为解读邻近标记数据集提供了重要的补充背景信息。
据我们所知，本综述提供了截至2026年9月在Leishmania、Trypanosoma cruzi和Trypanosoma brucei中报告的邻近标记应用的全面总结。除了成熟的策略之外，本综述还提出了尚未在动质体寄生虫中完全实现的新兴蛋白质组学技术的战略路线图。具体而言，它探讨了ipeAX [26]和PerTurboID [27]等平台作为解决特定实验限制的潜在解决方案，同时承认它们在动质体系统中的适用性仍有待验证。它还考虑了抗体靶向系统[12]、超分辨率邻近标记[28]和人工智能（AI）驱动的结构建模[29]在开发四维互作组图谱方面的潜力。通过将动质体定位为这些先进技术的新兴模型系统，我们提出了一个综合框架，用于复杂生物网络的系统级研究。

2. 邻近标记工具箱：从原理到工程化变体
不断扩展的邻近标记平台谱系为研究锥虫寄生虫的空间互作组提供了多种方法（图1）。传统的基于生物素连接酶的平台（如BirA*、miniTurbo和split-TurboID，图A-C）有助于蛋白质相互作用映射，而包括XL-BioID和基于过氧化物酶的APEX平台（图D-E）在内的专门策略则扩展了空间蛋白质组学研究的范围[28],[31]。在基于邻近关系的生物素化之后，标记的蛋白质通过标准化的蛋白质组学工作流程进行处理，包括细胞裂解、亲和纯化和质谱分析[4]。
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图1. 邻近标记策略和实验工作流程，用于在动质体中映射蛋白质-蛋白质相互作用。(A) BioID。将诱饵蛋白与一种杂合的生物素连接酶融合，生物素转化为生物素酰5-AMP，在约10纳米半径范围内标记附近的赖氨酸残基。这允许识别占据诱饵局部分子环境的蛋白质。(B) Split-TurboID。一种条件性的邻近标记平台，其中生物素连接酶被分解成两个无活性的片段。Rapamycin介导的FRB和FKBP域的二聚化触发生理复合物的形成，提供了对邻近关系标记的时间控制。(C) miniTurbo。一种工程化的、高活性的生物素连接酶变体（约28 kDa），能够缩短标记时间并在动态细胞过程中减少非特异性生物素化。(D) 结合交联剂的邻近标记。化学交联与邻近标记相结合，以在下游处理之前稳定瞬态或弱的分子关联，便于其恢复和检测。(E) APEX。一种基于过氧化物酶的方法，使用生物素-酚和H?O?生成短寿命的酚氧基自由基，在几秒钟内标记约10–20纳米范围内的酪氨酸残基，从而快速表征局部蛋白质环境。(F) 一般实验工作流程。标准化流程包括细胞裂解、使用链霉亲和素-coated beads纯化生物素化的蛋白质、珠上消化、质谱分析以及随后的生物信息学数据处理。这些步骤共同生成了寄生虫蛋白质组织的空间分辨快照，便于研究动态和特定区室的分子网络。BioRender.com用于生成此图。

2.1. 基于生物素连接酶的邻近标记：从经典的BirA到高效变体
2.1.1. BioID
这种方法依赖于诱饵蛋白（感兴趣的蛋白质）与一种杂合的生物素-蛋白质连接酶的融合[7]。最广泛使用的BioID版本中使用的杂合生物素-蛋白质连接酶是R118G，这是一种大肠杆菌BirA蛋白的突变形式（BirA*），其对生物素化反应的亲和力降低[6],[32]。在适当的细胞类型中表达BirA*-蛋白质靶标（PoI）融合是该方法的基础。当向培养基中加入生物素时，会诱导BirA*蛋白部分周围约10纳米范围内的蛋白质发生生物素化[31]。BioID具有几个重要优势，包括能够捕获瞬态或弱的相互作用，以及适用于膜相关和不溶性蛋白质。然而，该方法也存在重要限制，包括使用原始杂合生物素连接酶时无法检测蛋白质相互作用动态的时间快照。这种限制导致了由于所需的长时间生物素化（15–18小时）而增加的非特异性背景标记。此外，BirA*的相对较大尺寸（35.1 kDa；约321个氨基酸）可能会影响PoI的定位和功能[32]。
2.1.2. 双组分BioID (2C-BioID)
为了最小化BioID在BirA*-PoI融合蛋白大小方面的缺点以及持续存在的非特异性背景标记问题，BioID被修改并命名为双组分BioID (2C-BioID)[32]。该系统利用了成熟的FKBP:FRB rapamycin诱导的异二聚化系统[33]。在这种方法中，杂合的生物素-蛋白质连接酶与FKBP融合，而PoI与FRB融合。Rapamycin或生物不活跃的rapamycin类似物AP21967诱导FKBP:FRB寡聚化，从而将PoI和杂合生物素-蛋白质连接酶聚集在一起[32],[34]。2C-BioID方法的主要优势在于其优越的信噪比和时间控制。通过使用FRB:FKBP二聚化系统，只有当添加二聚剂（如rapamycin）时，杂合连接酶才会被招募到PoI上，有效地过滤掉背景噪声，确保生物素化仅发生在所需的细胞亚位置[35]。
2.1.3. TurboID和MiniTurbo
由于使用BirA*杂合生物素连接酶的BioID方法需要15–18小时才能实现强生物素化，这可能不适合某些应用，因此通过定向进化BirA*开发了TurboID和miniTurbo这两种生物素连接酶。TurboID和miniTurbo在加入过量生物素（5–50 μM）后仅10分钟内就能进行强生物素化[36]。TurboID被证明比原始BioID连接酶更快，并且这种杂合生物素连接酶能够在低温下有效工作[8]。TurboID与原始BirA*具有相同的大小（35 kDa），这可能会影响PoI的定位和功能。TurboID在其反应性生物素-5’-AMP结合基序（RBAM）中包含了14个突变，这些突变显著提高了TurboID的标记效率。一种名为miniTurbo的TurboID小型变体是通过去除TurboID的N末端而开发的[8]。MiniTurbo包含了14个RBAM突变中的12个。为了将标签大小减小到28 kDa，研究人员删除了N端的DNA结合结构域。这种删除似乎并不影响标记效率[37]。TurboID和miniTurbo已经被应用于各种研究中；然而，每种生物素连接酶都有其自身的局限性。TurboID比miniTurbo更高效，对生物素的亲和力更强，因此即使在培养基中生物素浓度较低的情况下也能进行高水平的生物素化。相比之下，miniTurbo的标记动力学较慢，但在缺乏外源性生物素的情况下背景活性较低，这为改善时间控制提供了可能性[8]。MiniTurbo是通过删除BirA基因的DNA结合结构域编码区而生成的，从而得到了一个更小的BirA衍生连接酶；然而，在某些情况下，这种修改似乎会损害蛋白质的稳定性[6]，[36]。对生物素连接酶的工程改造主要旨在生产标记动力学更快的酶。虽然这对于研究动态细胞过程显然是必要的，但更快的速度并不一定适合所有应用。TurboID的更高活性可能会导致背景信号增强，因为非目标蛋白质也会被标记；而BirA*的较慢动力学则可以产生更清晰的背景信号，因为只有真正的相互作用蛋白会在标记范围内停留足够长的时间以被有效地生物素化[6]，[36]。

2.1.4. Split-TurboID：推进动质体的条件蛋白质组学
邻近标记策略的发展已经从恒活性酶转向了提供更高空间和时间控制能力的条件系统。其中，Split-TurboID是一个重要的进步，它旨在解决全长TurboID高催化活性导致的背景生物素化问题，同时保持检测寄生虫动态生命周期所需的快速标记动力学[3]。Split-TurboID使用两个非活性的N端和C端连接酶片段，这些片段在“诱饵”和“猎物”蛋白质靠近之前保持催化不活跃状态，从而有助于重新构成功能性连接酶[3]，[38]。Split-TurboID分为高亲和力和低亲和力两种模式。高亲和力模式具有增强的片段间亲和力，特别适合绘制包括细胞器-细胞器膜接触位点在内的广泛相互作用界面。至于低亲和力Split-TurboID，其片段间的亲和力被有意降低，因此作为一个依赖于相互作用的生物素化系统[3]。这种额外的严格性对于检测拥挤的寄生虫结构（如布鲁氏锥虫的鞭毛囊）中的短暂蛋白质相互作用（PPIs）特别有价值[6]。寄生虫蛋白质组学中的一个主要挑战是检测快速的发育阶段转换。与早期需要16-24小时才能实现充分生物素化的Split-BioID不同，Split-TurboID能够在大约10分钟内高效完成生物素化[3]，[9]。这种标记速度的显著提升为寄生虫学研究带来了几个关键优势[39]，[40]。此外，缩短生物素标记时间还可以减少寄生虫的生理压力，并减少由于连接酶长时间活性引起的非特异性标记[3]，[40]。与原始BirA变体不同，基于TurboID的方法在30°C及更低温度下仍能保持高效率，使其适合许多昆虫阶段寄生虫所处的环境条件[3]，[40]。

2.1.5. XL-BioID：结合交联和邻近标记
动质体中传统邻近标记的一个重要限制是邻近蛋白质可能逃避生物素化，特别是当它们不含有可接触的伯胺基团或与诱饵的相互作用非常短暂时。为了解决这一挑战，开发了XL-BioID方法，在该方法中，将化学交联集成到BioID的工作流程中，以在蛋白质提取前稳定分子环境[6]。XL-BioID方法包括使用一种可渗透膜且对伯胺具有反应性的交联剂（如dithio-bis(succinimidyl propionate-DSP），在生物素化完成后进行交联。DSP具有12 ?的间隔基团，能够共价交联附近的蛋白质，从而稳定它们与生物素化诱饵的结合[6]。由于这些共价键在SDS缓冲液等严苛变性处理下仍然保持完整，XL-BioID允许共纯化邻近蛋白质并进行质谱分析[6]。这种额外的交联层在动质体中特别有用，因为那里高度组织的细胞骨架结构和动态蛋白质组装会使得使用传统的邻近标记工作流程时难以回收邻近相互作用蛋白。通过在进行蛋白质提取之前稳定局部分子环境，XL-BioID已被证明可以改善利什曼原虫中与着丝粒信号复合体相关的邻近蛋白质和磷酸化位点的捕获，从而提高了相互作用组的表征深度[6]，[41]，[42]。

2.2. 微型下一代连接酶：扩展连接酶工具箱
已经开发出多种细菌生物素连接酶BirA的工程变体，如AirID、UltraID和MicroID2，以提高邻近依赖性生物素化的效率和适用范围[6]，[10]，[11]，[43]。这些生物素连接酶通常具有改性的催化活性或改变的底物特异性，与原始BioID系统相比，能够提高生物素化效率并减少标记时间[9]，[44]。从第一代BioID向下一代连接酶的转变也解决了与酶大小相关的限制[10]。

2.2.1. AirID
AirID是一种用于邻近依赖性生物素检测的工程化BirA变体，旨在增强邻近依赖性生物素化。它是利用宏基因组数据集应用祖先重建算法开发出来的，生成了一种优化的BirA变体[43]。尽管AirID与原始BioID的序列相似度为82%，但在蛋白质-蛋白质相互作用映射中显示出显著更高的生物素化效率[3]，[43]。与仅通过R118G突变产生杂乱标记活性的原始BioID不同，AirID显示出显著增强的催化活性和生物素化效率[7]，[43]。值得注意的是，AirID通过提供比BioID更快的标记动力学以及比高活性的TurboID系统更高的特异性，从而减少了在高敏感性相互作用组映射中的背景标记[45]。AirID报告的增强特异性和降低的背景标记也可能对未来在动质体中的相互作用组研究有利，特别是在表征低丰度蛋白质复合体或高度动态的分子环境时，因为动质体寄生虫携带多种内源性生物素化的线粒体羧化酶，这些酶可能会产生背景生物素化信号[6]。

2.2.2. UltraID
UltraID是一种基于BirA的工程化连接酶，旨在满足对紧凑且高活性酶的需求。其大小约为20 kDa，明显小于原始的35 kDa BioID酶，是目前用于邻近标记研究中最小的生物素连接酶之一[11]。UltraID特别设计用于减少空间阻碍，这是密集包装的大分子复合体中蛋白质标记时常见的限制。其高催化活性使得在短短10分钟内就能实现有效的生物素化[11]，[46]。其快速的标记动力学相比第一代系统有显著改进，从而能够识别可能被时间平均效应掩盖的短暂相互作用[3]，[11]。凭借其紧凑的大小和快速标记动力学，UltraID可能成为空间受限的动质体隔室中邻近标记实现的一个有希望的替代方案，因为在这些隔室中，空间阻碍可能会限制较大连接酶变体的性能[6]。

2.2.3. MicroID2
MicroID2是紧凑型生物素连接酶设计中的一个重要进步，专门为克服空间受限细胞环境中常见的与大小相关的限制而开发。MicroID2通过C端截短并结合靶向突变来减轻生物素和ATP在活性位点的结合限制[3]，[10]，[47]。这些结构修改产生了一种更小、高活性的连接酶，背景标记显著减少。MicroID2仅包含180个氨基酸，是目前报道的最小生物素连接酶，是miniTurbo和TurboID等常用变体的更紧凑替代品[10]，[11]。MicroID2的一个主要优势是其相对于TurboID具有更低的背景标记，这对于在复杂蛋白质组学研究中保持高信噪比至关重要。对于需要精确时间控制的实验设置，还开发了低背景的MicroID2变体（lbMicroID2）。虽然lbMicroID2的标记效率较低，但其背景活性比亲本BioID2显著降低[3]，[10]，[47]。基于质谱的相互作用组学验证了MicroID2系统的有效性，能够有效地绘制不同亚细胞细胞器中的邻近蛋白质相互作用[10]。这种高分辨率映射在寄生虫学领域特别有用，用于分析复杂和短暂的蛋白质复合体[3]。考虑到动质体的密集细胞骨架结构和快速的发育转变，MicroID2在大小和效率上与UltraID相当，可能是未来在鞭毛囊和亚膜微管阵列等空间受限隔室中的有希望的应用候选者[3]，[10]，[11]。

2.3. 过氧化物酶介导的邻近标记
基于过氧化物酶的邻近生物素化采用与生物素连接酶不同的机制。在这种方法中，表达过氧化物酶并与目标蛋白（PoI）融合的细胞与酚类生物素衍生物（如生物素-酚）一起孵育，然后加入H?O?以启动邻近生物素化。像APEX2这样的酶利用H?O?氧化生物素-酚，形成高度活性的苯氧基-生物素自由基。这些中间体随后共价标记附近蛋白质中的酪氨酸残基[48]。APEX2介导的邻近标记的主要优点是其非常快速的动力学，允许在一分钟内完成标记。这种快速的时间尺度使其特别适合捕捉短暂和动态的细胞过程[49]，[50]。对于细胞表面蛋白，也可以使用辣根过氧化物酶（HRP）进行生物素化，可以通过将HRP与PoI融合表达或使用特异性针对该蛋白的HRP结合抗体来实现[52]。尽管HRP的催化活性高于APEX2，但它不能在细胞质中发挥作用，这限制了其在细胞内的应用，主要适用于细胞外或膜相关目标[53]。尽管过氧化物酶标记技术有助于捕捉邻近分子环境的快速快照，但它也有其缺点。标记需要H?O?，而H?O?具有细胞毒性，可能损害膜完整性，因此不太适合在完整生物体中进行邻近生物素化研究。此外，生物素化也可以由内源性过氧化物酶催化，这可能会增加背景信号。动质体中广泛使用的邻近标记技术的技术特性、空间分辨率能力和内在实验限制，以及新兴的下一代连接酶，在表1中进行了概述。

表1. 建立的和新兴的邻近标记平台的比较分析：性能指标和在动质体蛋白质组学中的战略应用

建立的邻近标记方法 | 方法/代次 | 酶/大小/中间体 | 空间-时间分辨率 | 目标残基 | 优点 | 局限性和实验瓶颈 | 参考文献
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BioID/（第1代） | BirA* / 35 kDa / Biotinoyl-5’-AMP | 低（18-24小时 / 10-30纳米） | 赖氨酸（K） | 被认为是绘制稳定结构支架（如副鞭毛杆）的金标准 | 慢速酶动力学（18-24小时），无法识别动态或短暂相互作用。长时间孵育可能导致高背景噪声和高移动性寄生虫中邻近蛋白质的生物素化[7] |
BioID2（第2代） | 截短的BirA*同源物 / 26 kDa / Biotinoyl-5’-AMP | 中等（12-24小时 / 10-20纳米） | 赖氨酸（K） | 尺寸减小，便于进入狭小空间（如鞭毛囊） | 尽管尺寸较小，但仍保持第一代的慢标记速度（15-24小时）。需要大量外源性生物素补充，可能会干扰动质体的独特生物素代谢[35]，[54] |
TurboID（第3代） | 工程化高活性BirA* / 35 kDa / Biotinoyl-5’-AMP | 高（10-30分钟 / ～10纳米） | 赖氨酸（K） | 有助于检测快速生命周期分化过程中的短暂信号 | 高活性可能导致在富含生物素的 Environment（如HMI-9或FBS添加的培养基）中的预标记，难以确定精确的时间零点。长时间活性还可能导致细胞毒性[8] |
MiniTurbo | 截短的TurboID / 28 kDa / Biotinoyl-5’-AMP | 高（10-30分钟 / ～10纳米） | 赖氨酸（K） | 尺寸小和速度快之间的最佳平衡；减少空间阻碍 | 与TurboID相比，蛋白质稳定性较低，在某些温度或特定细胞隔室中标记效率可能降低[8] |
Split-TurboID | TurboID的截短片段 / ～35 kDa（总数）/ Biotinoyl-5’-AMP | 高（10分钟-4小时 / ～10纳米） | 赖氨酸（K） | 提供条件（时间）或二元（空间）控制；专门设计用于识别细胞器接触点或大分子复合体中的蛋白质-蛋白质相互作用 | 由于个别片段的残留活性可能导致泄漏标记。化学诱导（例如雷帕霉素）可能导致宿主细胞的生理扰动。大的融合标签和二聚化结构域可能增加空间阻碍和蛋白质错位的风险[8] |需要精确的优化来减少环境生物素产生的背景噪音。[3]，[37]XL-BioIDBirA* 或 miniTurbo / 35 或 28 kDa / 生物素酰基-5’-AMP + 交联剂（例如 DSP）培养时间（12–24小时）/ 比率（10–30 nm）赖氨酸（K）和 N 末端与标准 BioID 相比，灵敏度提高了约 10 倍；使用 12 ? 的化学交联剂来稳定密集细胞骨架结构（如着丝粒）中的瞬时相互作用继承了其 BirA* 组件的缓慢动力学（18–24 小时）。添加化学交联剂（例如 DSP）需要严格优化浓度，以避免非特异性蛋白质聚集或在密集的寄生虫细胞骨架中产生结构伪影。[6]APEX2优化过的过氧化物酶 / 28 kDa / 羟基自由基超高效 / <1分钟 / <20 nm酪氨酸（Y）能够捕捉到快速变化的内吞途径和细胞器蛋白组由于需要过氧化氢，这会引发严重的氧化应激，可能会损害寄生虫的存活能力并改变蛋白组的生理状态。底物渗透性和精确的毫秒级定时要求带来显著的技术难度。[3]，[49]新兴的下一代邻近标记技术方法/代数酶/大小/中间产物时空分辨率目标残基优势局限性及实验瓶颈参考文献AirID原始 BirA / 约 35 kDa / 生物素酰基-5’-AMP培养时间（3–24小时）/ 比率（约 10 nm）通过从头设计的祖先酶重建实现；具有更高的生物素化活性和较低的细胞毒性，适用于长期体内实验与 TurboID 相比，动力学明显较慢（3–24小时），可能无法成功捕捉快速的毫秒级信号事件。该酶高度依赖于精确的生物素滴定（>0.5 μM）来减少在富集培养基（如 HMI-9）中的背景噪音；目前在不同动质体细胞器中的验证不足[44]UltraID工程化的 BirA / 19.7 kDa / 生物素酰基-5’-AMP高效（10–30分钟）/ 比率（约 10 nm）超紧凑且高活性的连接酶，无 DNA 结合结构。它能在最小空间影响下实现高时间分辨率；适用于受限的隔室（如鞭毛囊）极端的高活性（19.7 kDa）需要非常短的时间（例如 10–20分钟）以避免过度标记和空间特异性丧失。在高 FBS 补充的培养基中对微量生物素的高敏感性可能导致显著的预标记，使得在锥虫或利什曼原虫中难以确定精确的时间“零点”[11]MicroID2截短的 BirA / 约 19 kDa / 生物素酰基-5’-AMP高效（10–60分钟）/ 比率（约 10 nm）迄今为止最小的邻近依赖性生物素化酶（约 19 kDa）；尽管体积小，但在短时间内仍保持高效的标记效果。尽管体积极小（约 19 kDa），但在特定细胞条件下其催化核心可能表现出较低的蛋白质稳定性和溶解度。需要严格控制标记时间，以防在富集过程中链霉亲和素珠子饱和，从而掩盖密集细胞骨架中的低丰度瞬时相互作用[10]从动质体的角度来看，这些进步尤其关键，因为它们解决了几个反复出现的实验障碍，包括较长的标记时间、密集亚细胞隔室内的空间限制以及需要在接近天然条件下捕捉瞬时相互作用的需求。因此，邻近标记技术的发展方向是从提高催化效率转向根据具体生物学问题调整实验分辨率。3. CRISPR-Cas 的突破：利用精确的内源性标记推动邻近标记的发展CRISPR-Cas9 基因组编辑技术的出现显著改变了动质体中的邻近标记方法，使得从低通量分析单个蛋白质转变为大规模、系统性的全基因组相互作用组映射成为可能。在采用基于 CRISPR 的策略之前，如锥虫和利什曼原虫等寄生虫中工程化内源性融合构件的工作依赖于效率较低的同源重组方法，这些方法涉及劳动密集型的克隆步骤和漫长的筛选过程[6]，[55]。专用基因组编辑平台（尤其是 LeishGEdit 系统）的发展极大地简化了这一工作流程，能够在几小时内快速、无需克隆地将修改后的生物素连接酶插入内源性基因组位点[55]。CRISPR-邻近标记协同作用的主要优势在于能够在保持动质体基因表达复杂转录后景观的同时保留生理计量比。由于这些寄生虫缺乏传统的转录调控，其蛋白质水平主要由非翻译区决定，而非翻译区调控 mRNA 的稳定性和翻译效率[56]。现代基于 CRISPR 的标记平台能够在保留内源性非翻译区的同时实现药物筛选和生物素连接酶的融合[56]。这种精确度对于探究环境感知或发育转变的邻近标记研究尤为重要，因为在这些过程中，蛋白质的相互作用网络可能会因天然调控而发生显著变化[56]，[57]。基于 CRISPR 的策略通过在内源启动子下维持表达，减少了结构伪影，并最小化了与过表达模型相关的非特异性标记[55]，[58]。这种技术整合的效果在“暗蛋白组”注释和高通量定位项目中尤为明显。LeishGEM 等项目通过系统性地针对所有 8267 个编码蛋白质的基因进行删除，以及大约 2700 个基因进行内源性荧光标记，展示了高通量 CRISPR 基础标记的力量[13]。与之前的小规模研究相比，LeishGEM 使用了由超过 100 个专用质粒和数千个优化 sgRNA 设计支持的简化 96 孔板工作流程[13]，[56]。通过将显微镜技术与 LOPIT-DC（通过同位素标记和差速离心定位细胞器蛋白）结合，LeishGEM 项目生成了多层空间图谱，重点关注与 T. brucei 正交蛋白序列相似度低于 30% 的蛋白质，从而揭示了利什曼原虫蛋白组的“暗成分”[13]。这些工具的实际应用为多种动质体物种提供了高分辨率的洞察。在 T. brucei 中，研究人员使用第二代连接酶（如 BioID2（26 kDa）通过 CRISPR 检测到具有高再现性的瞬时相互作用[54]。此外，基于 APEX2 的邻近蛋白质组学成功地解析了特定鞭毛亚域的蛋白质组成，包括鞭毛尖端和 nedaxin-dynein 调控复合体，这些成分用传统生化方法难以纯化[14]。同样，CRISPR 介导的标记方法也被应用于 T. cruzi 中，以表征鞭毛和线粒体成分[59]。一项使用 TurboID 针对鞭毛隔室的关键研究鉴定出了 218 种富含鞭毛的蛋白质，其中 40 种在所有生活阶段都保守存在，揭示了寄生虫运动能力和宿主相互作用机制的新见解[3]。总的来说，CRISPR-Cas 技术成为将基因组潜力与邻近标记提供的高分辨率空间数据联系起来的关键桥梁。这种协同作用使得在动质体中实现了前所未有的功能注释水平，使研究人员能够将相互作用组数据纳入更广泛的适应性约束和精确的亚细胞定位框架中[21]，[55]。通过利用 CRISPR 系统性地用高活性连接酶标记候选蛋白质，该领域正朝着包括可溶性和不可溶性组分（如顶端和鞭毛区域的特殊细胞骨架组装）在内的全面寄生虫相互作用组地图迈进[58]，[59]。图 2 中展示了稳定 Cas9 表达系统与基于 PCR 的标记盒之间的战略性协同作用。该流程说明了如何通过 FRB:FKBP 异二聚化将有内源性标记的诱饵蛋白与微型化生物素连接酶 miniTurbo 条件性地耦合。通过结合这些技术，研究人员可以实现高分辨率的相互作用组映射，同时解决利什曼原虫中过表达伪影和时间控制的难题。下载：下载高分辨率图片（766KB）下载：下载全尺寸图片图 2. 利什曼原虫中 CRISPR-Cas9 和诱导型邻近标记的战略整合示例。A. CRISPR-Cas9 介导的内源性标记：在这个模型中，使用稳定表达 Cas9 和组成型 FKBP-miniTurbo-tHA 模块的母系利什曼原虫细胞系。PCR 生成的供体 DNA 可以实现无需克隆的精确标记，带有 FRB 功能的诱饵蛋白。该策略旨在保持生理表达水平，从而减少在动质体中常见的遗传结构和剂量敏感性挑战。B. 条件性耦合和邻近标记：该工作流程解释了雷帕霉素诱导的 FRB:FKBP 寡聚化在化学诱导时仅将 miniTurbo（28 kDa）连接酶招募到诱饵蛋白上的用途。该系统提供了一种精炼的方法，用于减少在生物素富集条件下常见的背景信号。诱导和补充生物素后，几乎在 10–15 nm 半径内的蛋白质会被生物素化，利用链霉亲和素进行富集，然后通过质谱分析，提供高保真度的局部蛋白质邻域快照，同时保持生理相关的表达水平，便于研究寄生虫特有的分子组织。4. 动质体中蛋白质-蛋白质相互作用映射的技术和生物学障碍：为什么邻近标记在动质体中的发展速度没有像在哺乳动物系统中那样快？邻近标记从哺乳动物模型向动质体寄生虫的转移揭示了连接酶生物化学前提条件之间的显著差异。虽然邻近标记已经改变了人类细胞中的相互作用组映射，但在动质体研究中的采用相对谨慎且渐进，受到了各种技术和生物学障碍的阻碍。这些挑战反映了寄生虫（如锥虫和利什曼原虫）内在的生物学限制，而不仅仅是工具开发的缺乏[6]，[60]。4.1. 动质体的空间和结构复杂性动质体细胞的高度有序和刚性结构组织对邻近标记方法的效率构成了重要的物理障碍。与相对流动的哺乳动物细胞胞质不同，动质体被密集的亚膜微管阵列所包围，这严格限制了蛋白质的扩散和细胞内运动[60]，[61]。这种极端的空间组织导致活性生物素腺苷酸中间体的有效标记半径显著缩短。在包括鞭毛轴丝或鞭毛囊在内的高密度亚区域中，这种受限的扩散可能导致高率的假阴性结果[14]，[62]。此外，离散细胞器的微米级邻近性增加了非特异性标记的风险，即由于简单的空间接近性，功能性无关的蛋白质也会被生物素化，可能会因非特异性背景信号的干扰而掩盖重要的分子相互作用[14]。4.2. 内源性标记的限制：遗传组织和剂量敏感性一个主要的概念性挑战来自于哺乳动物和动质体独特的遗传调控机制。瞬时过表达的便利性使得在哺乳动物系统中可以快速滴定邻近标记酶以获得最佳的信噪比。然而，动质体的独特遗传组织，其特征是多顺反子转录和广泛的 3′-UTR 依赖性转录后调控，使得传统的表达控制策略变得复杂[6]。因此，研究人员主要依赖内源性标记来维持生理计量比并避免错位伪影[63]。这种对内源性标记的依赖带来了多个障碍。首先，剂量敏感性使得精确控制酶的丰度变得复杂，因为传统的启动子缺失。由于表达水平是邻近标记研究中的关键决定因素，即使是与天然蛋白质水平略有差异，特别是在具有高度敏感调控系统的生物体中，也可能导致功能毒性[54]。其次，普遍存在的非整倍性和倍性变异（如 TriTrypDB 所示，特别是在利什曼原虫等物种中）使得生成同质的、双等位基因标记群体既费力又难以预测[13]，[64]。最后，与庞大酶融合相关的空间限制可能在像鞭毛双叶这样的空间受限复合体中造成显著的结构限制。这些修改经常干扰天然组装，因此促使采用更小的下一代连接酶（如 UltraID 或 MicroID2）来更好地维持内源性蛋白质功能[10]，[11]，[61]。4.3. 生物素代谢、氧化还原生物学和背景偏差动质体寄生虫中的内源性代谢产物使相互作用映射更加复杂。特别是，大量天然生物素化的羧化酶（包括乙酰-CoA 羧化酶、3-甲基丁酰-CoA 羧化酶和丙酰-CoA 羧化酶）的存在会在基于链霉亲和素的富集工作中增加背景信号[6]，[65]。在基于链霉亲和素的富集过程中，这些内源性生物素化蛋白质可能会增加邻近标记实验中的非特异性回收，从而降低有效的信噪比，并使低丰度邻近蛋白质的检测变得复杂[6]，[61]，[66]。因此，适当的匹配对照对于区分内源性生物素化蛋白质和通过邻近标记特异性富集的蛋白质尤为重要[61]，[66]。此外，动质体的内在生物素营养需求也带来了重要的代谢限制。由于这些寄生虫无法自身合成生物素，外源性生物素对于生物素依赖的邻近标记至关重要，但可能导致代谢扰动，包括在长时间标记期间的代谢压力[35]。因此，应针对个别动质体系统经验性地优化生物素浓度和标记时间，以最小化潜在的生理扰动，同时保持足够的标记效率[35]。高效生物素连接酶（如 TurboID 或 miniTurboID）在这种情况下可能通过促进更短时间内的高效标记而提供实际优势[35]。这些寄生虫特有的氧化还原环境（由硫辛酸系统介导）为基于过氧化物酶的策略（如 APEX2）带来了额外的挑战。由于 APEX2 的激活需要过氧化氢，暴露于过氧化氢可能会扰乱细胞内的氧化还原稳态，并可能影响天然相互作用组[14]。这种限制因温度悖论而进一步加剧，因为大多数用于邻近标记的酶都是为在37°C下的最佳性能而设计的，而昆虫阶段的动质体，包括布鲁氏锥虫的周期形式和利什曼原虫的前鞭毛体，通常在27°C下培养。这种温度差异可能会影响酶的活性和邻近标记的效率，因此需要针对不同的寄生虫阶段优化酶的选择和标记条件[14][54]。

4.4 生命周期动态和目标可及性
动质体具有复杂的生命周期，在昆虫媒介和哺乳动物宿主之间交替，由于与这些转变相关的快速发育重塑和动态代谢重编程，给空间蛋白质组学带来了独特的挑战[6]。这些发育转变伴随着寄生虫蛋白质组和细胞生理学的显著变化，因此在对实验状态的时间定义上是一个关键考虑因素[19][57]。检测这些阶段特异性的快照需要高时间分辨率和效率的邻近标记工具，如TurboID，它可以减少标记窗口并减轻样本处理过程中的环境压力[6]。对布鲁氏锥虫染色质因子的系统映射已经展示了这些策略在揭示转录起始和终止位点的新蛋白质网络方面的适用性，强调了需要能够解析动态相互作用状态的平台的必要性[67]。然而，目标可及性仍然是一个主要限制。在布鲁氏锥虫的血液型中，密集的变异表面糖蛋白（VSG）涂层对于免疫逃逸至关重要，但它创造了一个高度拥挤的表面环境，可能会限制对表面相关分子复合体的访问[68][69]。因此，在设计针对膜近端蛋白质的邻近标记实验时应该考虑到这种表面结构，尽管VSG涂层对邻近标记试剂的可及性或扩散的影响仍有待实验验证。

因此，由于寄生虫在生命周期转变过程中会经历pH值和温度的显著变化，包括在不同发育形式之间的分化，邻近标记平台需要足够的时间分辨率和敏感性来捕捉与这些生物适应性相关的短暂分子邻域[19][57][67]。这些阶段依赖性的变化也表明，邻近标记数据集之间的差异可能源于空间组织的变化和潜在细胞蛋白质组的变化。因此，在比较来自不同寄生虫状态的邻近标记数据集时，应该明确指定发育阶段、培养条件和相关环境参数[19][57]。重要的是，这些实验考虑在动质体寄生虫之间是不同的，反映了利什曼原虫、布鲁氏锥虫和克鲁兹锥虫在发育阶段、细胞结构和目标可及性方面的显著差异。专门结构的空间组织进一步强调了需要在特定的细胞背景下解释邻近标记数据集的必要性。在布鲁氏锥虫中，邻近蛋白质组学已经区分了不同鞭毛亚区域的蛋白质群体，而全基因组定位研究显示了寄生虫蛋白质组的广泛区室化组织[14][60]。在克鲁兹锥虫中，基于TurboID的邻近蛋白质组学同样揭示了前鞭毛体和细胞内无鞭毛体之间鞭毛富集蛋白质群体的阶段依赖性差异[66]。总的来说，这些结果突显了发育状态和亚细胞结构如何影响邻近标记数据集的组成。

表2概述了这三个动质体系统中设计与解释邻近标记实验相关的主要寄生虫和阶段特异性实验考虑因素。

表2. 不同物种间邻近标记实验考虑因素的比较。
寄生虫 / 发育阶段 / 细胞区室
寄生虫特异性实验特征
与邻近标记的相关性
实验考虑

利什曼原虫属
蛋白质组在生长阶段转变和应对温度压力时会发生广泛的重塑。
在不同发育或环境条件下生成的数据集可能会反映出不同的细胞蛋白质组状态，以及空间组织的差异。
因此，在比较不同实验状态下生成的邻近标记数据集时，应明确定义发育和环境条件[19]。

布鲁氏锥虫血液型和周期形式
血液型和周期形式之间的蛋白质丰度和代谢途径存在显著差异。
细胞蛋白质组的阶段特异性差异可能导致邻近标记数据集之间观察到的差异。
在比较邻近标记数据集时，应将发育阶段视为一个明确的实验变量[57]。

布鲁氏锥虫鞭毛
鞭毛包含可以通过邻近蛋白质组学分辨的空间上不同的亚区域。
邻近标记可以区分同一 organelle 不同区域的蛋白质群体。
在解释邻近标记数据集时，应定义诱饵定位和特定的鞭毛亚区域[14]。

布鲁氏锥虫血液型表面
血液型细胞表面被密集的VSG涂层覆盖，活体寄生虫上的VSG C末端结构对抗体不可及。
这种特殊的表面结构对于针对膜近端分子环境的实验来说是一个潜在的可及性限制。
目标选择和解释应考虑表面近端分子环境的可及性[68][69]。

布鲁氏锥虫鞭毛口袋
鞭毛口袋是一个特殊的膜域，是内吞和外吞作用的唯一场所，其边界受到潜在细胞骨架的影响。
鞭毛口袋是一个高度特化的膜域，可能会影响邻近标记蛋白质组的局部组成。
候选蛋白质应在其区室定位的背景下进行评估，使用正交验证来区分真正的邻近关系和间接或空间限制的关联[20]。

克鲁兹锥虫前鞭毛体和细胞内无鞭毛体
基于TurboID的邻近蛋白质组学在前鞭毛体和细胞内无鞭毛体中识别出了不同的鞭毛富集蛋白质群体，两者之间有40种蛋白质是共有的。
在同一寄生虫物种的不同发育阶段，邻近标记谱可能有所不同。
在生成和比较邻近标记数据集时，应将发育阶段视为一个明确的实验变量[66]。

克鲁兹锥虫鞭毛富集蛋白质组
鞭毛富集的数据集包含了克鲁兹锥虫特有的蛋白质和假设蛋白质。
有限的功能注释可能会使邻近标记衍生的候选物的生物学解释变得复杂。
注释不足的候选物可能需要额外的定位或功能验证[66]。

这些差异强调了应在每种寄生虫系统的具体发育、结构和实验背景下解释邻近标记数据集，而不能将其视为寄生虫蛋白质组织的直接可互换表示。

4.5 注释、同源性以及“黑暗蛋白质组”的挑战：功能验证的限制
即使邻近标记实验产生了高质量的数据集，它们的生物学解释也可能受到动质体蛋白质组中特征不充分的部分的限制，这里称之为“黑暗蛋白质组”。动质体蛋白质组的相当一部分仍未完全表征或被注释为假设蛋白质。因此，许多邻近标记衍生的候选物仍然没有实验确定的函数或足够清晰的功能注释，这使得仅基于邻近关系来分配生物学角色变得具有挑战性[21][70]。这些注释和表征的空白可能需要对每个基因进行劳动密集型的实验验证，因为仅基于邻近关系的证据不足以自信地推断功能关系[70][71]。值得注意的是，邻近标记本身并不能直接建立物理相互作用，因为在有效标记半径内可以捕获相互作用的和非相互作用的蛋白质[72]。因此，邻近标记衍生的关联应与互补的实验或计算证据一起解释，以支持功能解释。独立的相互作用数据集可以提供评估邻近标记衍生动关联的正交证据层。然而，基于相互作用数据的功能注释仍然可能具有挑战性，特别是当相互作用蛋白质本身特征不足时。这种限制可能会使邻近标记数据集的生物学解释变得复杂[64][71]。整合互补证据，包括无标签的相互作用数据集、亚细胞定位、遗传扰动和结构预测，可以支持对先前未表征蛋白质的优先排序和功能研究[13][21][22][56]。在这方面，人工智能辅助的结构预测可以为评估候选蛋白质相互作用的结构性合理性提供额外的计算层[73]。最近对AlphaFold-Multimer和更新的AlphaFold3的基准测试展示了它们预测复杂蛋白质-蛋白质相互作用的能力，尽管它们的预测性能可能因相互作用类型和生物学背景而异[74]。因此，这些预测应被视为支持性证据，而不是决定性的实验验证。为了进一步评估这些结构预测的可靠性，可以使用诸如预测对齐误差（PAE）之类的指标，以及精心策划的多序列比对（MSAs），来帮助评估预测蛋白质复合体的可靠性和结构合理性[75]。将这些计算预测与实验邻近标记、相互作用、定位和遗传证据结合起来，可以为从基于邻近标记的候选物识别向动质体“黑暗蛋白质组”的功能注释提供更坚实的框架。

5. 案例研究：利什曼原虫和锥虫中的邻近生物素化
在动质体中实施邻近标记已经从表征单个蛋白质复合体发展到建立全基因组相互作用图谱和高分辨率的空间蛋白质组图谱。虽然2022年之前的基础研究已由Geoghegan等人进行了彻底回顾[6]，但本节重点介绍了2023年至2026年间报告的方法学和生物学进展。在这段时间里，邻近标记越来越多地与无标签定量蛋白质组学和人工智能辅助的结构预测工具集成，提高了蛋白质相互作用数据集的可靠性，并使其生物学解释成为可能。图3提供了动质体寄生虫中邻近标记目标的空间概览，展示了利什曼原虫和锥虫中核心亚细胞蛋白质的分布，以及在它们高度极化的细胞器结构中应用多种酶促邻近标记平台的情况。表3总结了所有报道的动质体中的邻近标记研究，涵盖了早期和近期的研究。通过在鞭毛口袋、核孔和线粒体kDNA界面等亚细胞区室内映射相互作用组，这些案例研究展示了现代邻近标记工作流程的力量，为大部分未表征的动质体“黑暗蛋白质组”提供了功能见解。

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图3. 用于研究动质体寄生虫中空间组织蛋白质网络的邻近生物素化目标的示意图。卡通剖面图风格图显示了（A）利什曼原虫和（B）锥虫中邻近生物素化诱饵蛋白质的细胞定位。符号表示每种研究中使用的特定邻近标记策略，包括BioID、BioID2、APEX2、miniTurbo、XL-BioID和TurboID。映射的目标覆盖了关键的亚细胞结构和细胞器，包括鞭毛口袋、细胞核和线粒体kDNA界面。请注意，许多表示的蛋白质在整个寄生虫细胞周期中显示出动态的亚细胞定位。

表3. 动质体寄生虫中邻近标记策略的代表性实施。
锥虫中的邻近标记应用

物种
诱饵蛋白质
细胞器 / 阶段
酶 / 方法
表达的诱饵
对照
关键生物学见解

布鲁氏锥虫周期形式
MORN1
双叶结构 / FAZ
BirA* / BioID 和 MST
四倍体诱导等位基因
首次在动质体中成功应用BioID；确定了七个新的双叶结构成分和两个鞭毛附着区蛋白质，将双叶结构表征为鞭毛口袋的重要支架[61]

布鲁氏锥虫周期形式
PLK
基体 / SAS-4
BirA* / BioID 和 Phospho-proteomics (SILAC 和 iTRAQ)
四倍体诱导等位基因
这项研究确定了一组与TbPLK相关的蛋白质，这些蛋白质定位于鞭毛连接器、鞭毛附着区和双叶结构，并建立了TbPLK介导细胞形态发生的分子网络，表明这些蛋白质对于动质体的定位、鞭毛附着和成功的细胞分裂是必需的[76]

布鲁氏锥虫周期形式
SAS-4
基体附近 / 新FAZ尖端
BirA* / BioID 和 LC-MST
四倍体诱导等位基因
BioID分析检测到与TbSAS-4相连的FAZ尖端蛋白质复合体，并表明TbSAS-4调节FAZ细丝的延长、基体定位和布鲁氏锥虫的生命周期相关形态转变[77]

布鲁氏锥虫周期形式
CIF1
鞭毛 / FAZ
BirA* / BioID 和 LC-MST
四倍体诱导等位基因
检测到CIF2（一种EF-hand蛋白）作为CIF1的重要稳定剂。CIF2在新的FAZ尖端与CIF1物理相互作用，抑制其降解；没有CIF2，CIF1不稳定，导致细胞分裂初始化完全受阻[78]

布鲁氏锥虫周期形式
RBP9, RBP10
细胞质 / RNA结合蛋白
BirA* / BioID 和 RNA-seq
四倍体诱导等位基因
表达GFP-BirA*的品系确定RBP10为生命周期阶段的主要调节因子；BioID识别出超过200个参与mRNA代谢的相互作用因子，证明RBP10的表达足以触发从周期形式到血液型的转录组转变[79]

布鲁氏锥虫周期形式
NuSAP1, NuSAP2, NuSAP3, Kif13–1, TbMlp2, TbAUK1
细胞核 / 有丝分裂纺锤体
BirA* / BioID 和 RNA干扰 (RNAi)
四倍体诱导等位基因
该研究揭示了布鲁氏锥虫使用一组独特的不同蛋白质来管理其有丝分裂纺锤体的动态。通过将BioID与RNAi结合，研究人员能够映射纺锤体相关蛋白质组，并显示这些蛋白质具有非冗余的独特功能：NuSAP1作为通向动质体特异性着丝粒的桥梁，而NuSAP2和NuSAP3对于完成有丝分裂的各个阶段是重要的[80]

布鲁氏锥虫周期形式
TOEFAZ1 (=CIF1)
鞭毛附着区 (FAZ) - 切裂沟 / 细胞分裂沟区域
BirA* / BioID
四倍体诱导等位基因
TOEFAZ1是布鲁氏锥虫中组织细胞分裂的FAZ尖端支架蛋白。它定位于FAZ尖端和裂解沟，与多个细胞分裂调节因子相互作用，是裂解沟进入和细胞分裂所必需的研究表明，胞质分裂与FAZ（着丝粒附着区）相关，而非依赖于肌动蛋白-肌球蛋白环结构。[81] T. brucei中的CIF1以循环形式存在，形成新的鞭毛附着区尖端。BioID和RNAI的检测结果表明，Tet诱导的CIF1等位基因与早期数据集有相似性。研究确定CIF1是胞质分裂的主要调控因子，它负责在新的FAZ尖端空间组织分裂机制。BioID还发现CIF1作为支架，招募CIF2、CIF3和Aurora B激酶到胞质分裂起始位点。实验表明，CIF1对这些调控因子的招募对于启动标准的前后细胞分裂过程是必需的。[82] T. brucei中的FPRC将CIF1招募到胞质分裂起始位点，启动细胞分裂。[77] 在T. brucei中，ZapE1、ZapE2、IscU和LigK-beta通过BioID2标记，揭示它们在细胞器空间分布上的相互作用。通过适应性改造的BioID2技术，研究发现ZapE2是Oxa1介导的内质膜蛋白插入的负调控因子。[63] T. brucei中的FAZ27在维持锥形鞭毛形态方面起关键作用，与FLAM3和ClpGM6共同作用，参与FAZ区域的形成。[83] TbSpef1被证实是第一个特异性定位在微管四聚体上的蛋白质，TbSpef1的邻近标记技术揭示了TbSAF1作为基础体蛋白的重要性，这对鞭毛结构和单拷贝细胞器的遗传至关重要。[84] Unc119的 arginine激酶功能被证实与TbAK3的鞭毛定位相关，TbUnc119的缺失会影响TbAK3的富集。这些研究证实了T. brucei中LIFT通路的保守性，并揭示了TbUnc119与TbArl3A（而非TbArl3C）之间的GTP依赖性相互作用。[85] TAC102在核仁/线粒体相互作用中起关键作用，其研究方法消除了传统生化方法的限制，成功解析了三部分附着复合体的组成。这些基于邻近性的研究证实了TAC102在调控线粒体DNA分配和精确遗传中的核心作用。[44] APEX2技术的应用在T. cruzi中首次实现，CRISPR-Cas9介导的内源标记技术保持了蛋白质的生理比例，促进了鞭毛亚区的原位映射，揭示了鞭毛尖端富集的腺苷酸环化酶，强调了鞭毛尖端作为cAMP信号中心的特殊作用。[66] 利用TurboID的邻近标记技术，研究人员绘制了T. cruzi鞭毛的全面蛋白质图谱，发现了218种在锥形鞭毛阶段富集的蛋白质和99种在无鞭毛阶段富集的蛋白质，这些蛋白质包含40个共有成分，表明邻近标记技术是表征鞭毛组成的有效方法。[66] NUP76和MEX67的研究揭示了核孔复合体的高度不对称性，Ran通路极性和NUP76的依赖性表明方向性mRNA输出由这种特殊的NPC结构介导。[86] PEX19的研究确定了其作为真核生物特有过氧化物酶的重要性，它作为适配器连接Hip和PEX19的PEROXIN结合位点，稳定膜蛋白。T. cruzi中的BDF3等蛋白质的研究展示了其在染色体组装和细胞器靶向中的作用。[88] 在Leishmania中的应用方面，KHARON标记技术揭示了L. mexicana中细胞骨架蛋白复合体的存在，这些蛋白对细胞内无鞭毛阶段的存活至关重要。[89] KKT2和CLK2的研究揭示了细胞周期依赖性的磷酸化过程，AB1的干扰导致严重的胞质分裂缺陷，表明细胞周期蛋白磷酸化与寄生虫细胞分裂相关。[86] 最近的研究利用TurboID和ChIP-seq/RNA-seq技术，将BDF5定位到转录起始位点，揭示了其在染色质关联网络中的作用。[90] 最新研究利用AI辅助的方法建立了T. donovani的全基因组蛋白质相互作用网络，为比较不同物种间的相互作用提供了重要基准。[91]这种化学计量映射策略为染色质修饰复合体结构的表征奠定了基础，显示BDF3、BDF5和BDF8是CRKT复合体的一部分，而BDF6与NuA4复合体相关联，从而提供了T. cruzi表观遗传组织的高分辨率视图[88]。6. 正交验证和数据协同作用：从邻近标记数据构建高置信度的细胞图谱依赖于互补组学数据集的整合。如图4所示，该多模式框架将空间层（由TurboID和APEX2衍生的邻近数据集表示）与物理层（由16,095个相互作用的L. donovani SEC-MS互作组定义）以及结构层（由AlphaFold 3辅助）相结合。正如2024年年度方法“空间蛋白质组学”所认可的那样，这种整合方法增强了将假想蛋白质分配给真实的大分子组装体的信心，而不是随机邻近事件[96][97]。通过整合空间、相互作用和结构信息，该框架提供了一种强大的验证方法，有助于对动基体的暗蛋白组进行功能注释，并区分背景驱动的相互作用和真实的相互作用[21][28]。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像。图4. 多模式数据协同作用用于高置信度的动基体互作组映射。为了整合空间、物理和结构信息以实现高置信度的动基体互作组映射，可以考虑三个互补的组学层次：（i）物理层，使用无标签基准，包括16,095个相互作用的L. donovani网络来提供蛋白质连接性的正交证据；（ii）空间层，应用邻近标记来识别亚细胞邻域；（iii）结构层，使用AlphaFold 3来提供多实体复合体的结构模型。这种协同框架有助于区分空间邻近性和物理相互作用以及结构合理性，从而提高对动基体暗蛋白组中特征不明显的蛋白质的优先级和功能注释。6.1. 数据采集的进步：向DIA-PASEF和无文库搜索的转变：为了充分利用高分辨率邻近标记的潜力，质谱数据采集方法必须超越传统依赖数据的采集（DDA）的限制。虽然无标签定量和串联质量标签（TMT）基的工作流程仍然被广泛使用，但它们分别受到随机前体采样和比率压缩的限制。这些问题在研究寄生虫互作组中的低丰度成分时尤其显著[98]。2025-2026年的技术进步突出了数据独立采集（DIA）的部署，特别是DIA-PASEF，它提供了更高的灵敏度和几乎完整的数据矩阵，且缺失值极少[99]。对于动基体研究而言，许多调节和信号蛋白存在于检测的极限范围内，DIA-PASEF允许对这些低丰度的“暗”相互作用体进行一致量化，而这些在基于DDA的邻近标记筛选中往往被忽视[98]。此外，无文库DIA搜索方法的发展，利用dia-NN和Spectronaut等工具，消除了耗时的、特定于样本的光谱文库生成需求[98][100][101]。这对于非模式生物和Leishmania及Trypanosoma的特定生命周期阶段来说是一个重大进展，因为在这些生物中实验材料往往很稀缺。通过将无文库DIA与邻近标记相结合，可以生成真正全局的互作组基准，补充无标签验证方法，从而提高推断蛋白质相互作用的生物学相关性[98]。6.2. SEC-MS和共分离：通过监测亚单位的共洗脱，尺寸排阻色谱技术与质谱技术相结合，可以并行检测数百个蛋白质复合体在其天然状态下的存在[102]。这种策略对于动基体研究特别有价值，因为它提供了在天然、未受干扰条件下生成的正交参考框架。Azimi和Salavati进行的一项关键研究首次绘制了L. donovani的实验性全局蛋白质相互作用网络。该研究量化了3468种蛋白质，并解析了一个包含1509个节点的高置信度网络[21]。由此产生的TrypsNetDB数据库为邻近标记数据集提供了有价值的交叉验证资源。通过将基于共分离的组学方法与邻近标记工作流程相结合，研究人员可以增强对候选蛋白质相互作用的信心，并有助于区分真实的蛋白质复合体和随机邻近衍生的相互作用[21]。6.3. XL-MS：为邻近数据添加结构约束：为了应对邻近标记的固有限制，包括对基因修饰的要求和标签诱导的伪影风险，越来越多地整合了互补的天然组学策略，以生成推断相互作用网络的正交证据。虽然SEC-MS基于蛋白质共分离提供了物理关联的证据，但XL-MS增加了解释蛋白质相互作用所需的结构背景。XL-MS通过确定氨基酸残基之间的具体物理连接位点，提供了额外的证据层，从而为邻近标记无法解决的分类提供了残基级别的结构约束[103]。与仅识别纳米级邻近区域的邻近标记不同，先进的体内XL-MS能够在天然细胞环境中以残基级别精度捕获相互作用[104]，并提供结构约束，有助于使用交联剂解释直接的分子界面[105]。将SEC-MS与邻近标记相结合，引入了一个独立的基于共分离的证据层，用于评估被识别为空间邻近的蛋白质是否也在天然分子组装中共同存在[21][22][106][107]。然而，共分离策略可能会产生由随机共洗脱引起的模糊关联，因此需要适当的统计和计算方法来进行相互作用推断[106][107]。XL-MS通过残基级别的结构约束为候选关联提供了额外的结构维度，有助于确定空间邻近的蛋白质是否具有直接的物理界面[103][104]。然而，XL-MS也容易出现错误识别，因此在全蛋白质组应用中需要适当的蛋白质-蛋白质相互作用水平的假发现率控制[108]。这种能力对于解析密集包装的寄生虫区室中的复杂蛋白质景观非常重要，如通过将XL-MS与机器学习结合进行Toxoplasma gondii互作组映射所示，从而获得了高置信度的覆盖[23][105]。因此，邻近标记、SEC-MS和XL-MS提供了互补而非可互换的证据，邻近标记报告空间邻近性，SEC-MS提供天然分子组装的共分离证据，XL-MS贡献残基级别的结构约束。6.4. 人工智能整合的组学：从结构验证到暗蛋白组的功能注释：人工智能（AI）、机器学习（ML）和空间蛋白质组学的日益融合为邻近标记数据集的解释提供了新的途径，特别是通过促进复杂组学和结构信息的计算整合。尽管TurboID及相关邻近标记平台提供了出色的空间分辨率，但它们受到随机噪声和非特异性标记的影响。这些限制在动基体中尤为明显，因为阐明功能上未表征的暗蛋白组需要结合高灵敏度的蛋白质组数据和预测性结构建模[98]。为了充分利用AI驱动的过滤，需要高质量的质量谱数据。向数据独立采集（特别是DIA-PASEF）的转变促进了接近完整数据矩阵的生成，并提高了灵敏度，为基于ML的评分提供了坚实的基础[98][99]。同时，无文库搜索方法（如dia-NN）为低丰度调节蛋白的一致量化铺平了道路，并在复杂的蛋白质组数据集中显示出稳健的性能，使其在未来Leishmania的应用中具有吸引力[99]。这些高保真数据集可以为监督式ML模型（包括随机森林和梯度提升）提供有价值的输入，这些模型可以将邻近标记输出与正交的无标签证据相结合，以区分真实的蛋白质复合体和短暂的空间相互作用[98]。6.4.1. 通过全局SEC-MS网络进行正交基准测试：独立的物理互作组数据集为验证邻近标记衍生的相互作用候选者提供了重要的正交基准。最近的一项SEC-MS研究与监督机器学习相结合，首次生成了L. donovani的基因组规模蛋白质相互作用网络，包含16,095个预测的相互作用[21]。将TurboID衍生的邻近蛋白质与这个参考网络进行比较，使先前未表征的蛋白质涉及的候选相互作用得以优先处理，同时有助于区分高置信度的关联和潜在的实验背景[21][22]。因此，空间邻近数据与物理共分离证据的结合为蛋白质关联提供了互补支持，并增强了生物相关分子组装映射的信心[22][94]。6.4.2. 使用AlphaFold 3（AF3）进行多实体结构建模：AF3的出现显著推进了全蛋白质组互作数据集的结构解释。与它的前身相比，AF3具有基于扩散的架构，能够在统一框架内模拟蛋白质、核酸和小分子配体的相互作用[96]。这种能力对于动基体尤其相关，因为动基体具有专门的RNA编辑机制和非传统的调节机制，这些机制仅通过序列同源性难以解析。将AF3预测与高置信度的邻近标记数据集相结合，可以促进先前未表征蛋白质复合体的结构解释[29]。同时，将AF3与KRONOS等生物基础模型相结合，可以通过将结构预测与空间相互作用网络相结合，进一步增强动基体暗蛋白组的功能注释[99]。这种综合分析为先前未表征蛋白质的结构解释铺平了道路，并支持检测寄生虫特有的分子组装，包括可能作为治疗靶点的假定配体结合界面[23]。总之，这些由AI支持的策略为将空间蛋白质组学与结构生物学联系起来提供了框架，从而有助于将互作组数据集转化为机制洞察和潜在的治疗途径[28]。7. 新兴前沿：超越酶动力学7.1. 以位点为中心的组学和抗体驱动的邻近标记：除了内源标签蛋白外，该领域正转向使用催化不活跃的Cas (dCas) 变体进行位点特异性的组学研究。dCas9和dCas13与邻近标记酶（如TurboID或APEX2）的结合为阐明动基体基因组和转录组的空间结构打开了新途径[109]。由于这些寄生虫的基因调控主要发生在转录后水平，基于dCas13的RNA邻近标记提供了一种稳健的方法来映射在mRNA稳定性和翻译控制中起作用的RNA-蛋白质复合体[56][109]。从以蛋白质为中心的映射向以位点为中心的映射的转变可能对表征与特定基因组元素和非编码RNA结构相关的暗蛋白组非常有用，有助于高分辨率地观察支撑寄生虫适应的调节枢纽[6][109]。新兴的CRISPR引导的邻近标记工具，包括基于CRISPR的RNA邻近蛋白质组学（CBRPP）和基于CRISPR的RNA-联合相互作用系统（CRUIS），使用dCas13与邻近标记酶融合来检测与特定内源RNA相互作用的蛋白质[110][111]。CBRPP能够在天然环境中富集RNA结合蛋白，提供对转录本空间调控的见解[109][110]。同时，CRUIS使用PUP-IT连接酶系统标记与目标RNA相互作用的蛋白质，为检查密集的RNA-蛋白质颗粒提供了另一种方法[109][110]。这些方法可能有助于解码多顺反子转录本如何选择性地组织到专门的区室中，包括应激颗粒或RNA处理中心[110][112]。除了以位点为中心的诱饵方法外，如ProtA-TurboID等抗体驱动的邻近标记策略可以将邻近标记应用于难以进行稳定基因组整合的临床Leishmania和Trypanosoma分离株[3][113]。这种非遗传方法依赖于与Protein A-TurboID融合的位点特异性抗体，用于在透膜细胞中生物素化邻近蛋白质组[113]。值得注意的是，由于诱饵是在蛋白质水平而不是基因组位点定义的，这种方法允许研究人员捕获依赖于修饰的互作组（例如，磷酸酪氨酸连接状态），这些在表位标记平台中往往无法获得[3][113]。此外，目前正在开发光激活的替代方法，如CAT-Prox，其中亚细胞定位的光催化剂为活体初级样本中的相互作用伙伴提供了非遗传框架[114]。如果应用于Leishmania或Trypanosoma，这些策略可以促进患者来源或载体阶段寄生虫的研究，补充以位点为中心的邻近标记工作流程[12]。7.2. PerTurboID：量化遗传和环境扰动的影响：除了生成静态相互作用图外，该领域正越来越多地转向通过PerTurboID等方法进行扰动解析的蛋白质组学，这些方法用于检测局部蛋白质环境中的动态变化。最近在Plasmodium falciparum中的应用表明，PerTurboID优先量化特定细胞扰动如何重塑分子邻域[27]。通过整合位点特异性的生物素化肽定量与靶向遗传扰动（包括FIKK4.1激酶敲除），该方法能够表征单个基因丢失如何影响邻近蛋白质复合体，包括细胞粘附复合体[27]。在运动粒体中，阐明药物诱导压力或阶段特异性调控程序的下游后果仍然是一个关键挑战，PerTurboID有可能为监测特定遗传或环境扰动后的蛋白质组重组提供一个高分辨率框架[27]。7.3. iAPEX：通过酶级联反应减轻氧化应激尽管基于过氧化物酶的方法（如APEX2）能够实现极快的标记动力学（几乎1分钟），但它们对外源过氧化氢的依赖可能会引起相当大的毒性和细胞压力，尤其是在寄生虫发育的脆弱阶段。ipeAX（改进的APEX）策略通过一种酶反应级联反应在标记部位直接生成所需的氧化剂，从而解决了这一限制[26]。通过将APEX2与D-氨基酸氧化酶共定位，该系统在局部生成活性氧化剂，从而在保持亚纳米级空间精度的同时减轻广泛的氧化损伤。虽然ipeAX已在哺乳动物细胞系统和非洲爪蟾（Xenopus laevis）中进行了实验评估[26]，但其在运动粒体寄生虫中的应用尚未确立，其对这些系统的相关性仍有待确定。这种方法可能特别适合研究敏感的运动粒体结构，如鞭毛口袋和线粒体嵴，这些结构需要保持细胞稳态[26]。7.4. 光接近标记和超分辨率PL：运动粒体互作组学的可行性考虑目前，接近标记平台的发展正在超越酶驱动系统的动力学和氧化限制，朝着两个概念上不同但在操作上兼容的方向发展：光激活标记和亚细胞器空间区分[12]。光接近标记通过使用光响应催化剂（包括合成染料和基因编码的光敏剂）将生物素化与酶转化分离，能够以毫秒级的时间精度启动自由基生成，从而超越了TurboID或APEX2方法通常需要几分钟到几小时的标记时间窗口[115]。这种改进的时间分辨率对于运动粒体特别重要，因为关键细胞周期事件（如基体复制、鞭毛口袋重塑和kDNA分离）发生在严格限定的时间窗口内。然而，尚需通过实验证明，这些光激活系统是否可以在这些寄生虫的巯基硫醇缓冲胞质环境中维持类似的动力学控制[98]、[116]。近红外（NIR）光标记原则上可以将这一策略扩展到整个细胞或类器官阶段的寄生虫，因为NIR波长具有更深的组织穿透性和较低的光毒性[115]。然而，这些特性是否可以在昆虫阶段运动粒体密集的膜下微管网络和接近27°C的生理温度窗口下得到保持，仍有待实验验证[117]。同时，超分辨率接近标记（SR-PL）试图解决传统接近标记策略的空间限制，其中约10-20纳米的标记半径可能会阻碍亚区室组织的观察，通过将同位素编码探针与高分辨率质谱技术相结合[28]。这有助于通过基于同位素的接近比例而不是绝对信号强度来解析亚细胞器域，并已被用于解析传统生物素化策略难以分辨的线粒体晶体内空间[28]。在运动粒体寄生虫中，SR-PL可能进一步实现动态嵴重塑和kDNA网络拓扑结构的解析，前提是探针的递送不会破坏依赖于巯基硫醇的氧化还原稳态[28]、[117]。与XL-MS和AlphaFold 3模型的集成可以进一步将解释从邻近级别的接近图扩展到界面解析的结构模型[23]、[98]。8. 未来展望：迈向多模态运动粒体互作组学图谱2026年之后，运动粒体互作组学预计将越来越多地结合空间蛋白质组学、定量相互作用映射和结构建模，形成统一的分析工作流程[12]、[98]。这种组合对于运动粒体寄生虫尤其重要，因为极端的细胞区室化和特定谱系的细胞器给传统寄生虫学方法和传统蛋白质组学工作流程带来了持续的挑战。图5中展示的工作流程应被视为这种集成流程的概念性示例，而不是规定性或排他性的流程。实际上，可以根据生物学问题和实验限制，使用替代方法，包括不同的基于CRISPR的内源标记系统、PL酶或招募方法。下载：下载高分辨率图像（795KB）下载：下载全尺寸图像图5. 生成多模态运动粒体互作组学图谱的10步集成流程。该工作流程整合了内源标记、接近标记、定量蛋白质组学、正交互作组学映射、结构建模和计算分析，以连接空间、物理和结构证据，重建跨寄生虫阶段和亚细胞区室的生物学可解释的蛋白质相互作用网络。该框架特别旨在支持对运动粒体暗蛋白质组中注释不足的蛋白质进行优先排序和功能表征。使用BioRender.com生成了该图。它从CRISPR-Cas9介导的内源标记开始，结合可诱导的接近标记酶（如miniTurbo）的招募，允许在接近天然条件下对蛋白质邻域进行原位标记。这些实验通常接着进行DIA-PASEF采集和无文库鉴定策略，与低输入寄生虫系统中的数据依赖采集相比，这些方法提供了更高的深度和定量一致性[99]。为了将这些数据置于生物学上有意义的框架中，可以考虑三个互补的层面。首先是空间层面，从寄生虫学的角度来看尤其相关，因为它捕捉了运动粒体细胞强烈极化和高度区室化的组织。接近标记平台提供了局部蛋白质环境的时间快照，而包括光接近标记和同位素解析策略在内的新兴方法可能进一步提高亚细胞器级别的空间分辨率[28]。其次是物理相互作用层面，这与系统级蛋白质组学更为一致。大规模的相互作用数据集，包括L. donovani和T. cruzi中大约16,000个相互作用的网络，为网络组织提供了全局参考框架。当与XL-MS结合时，这些数据集可以帮助区分稳定的蛋白质复合物和瞬态或仅空间共定位但无相互作用的物种[21]、[22]、[108]。第三是结构层面，得益于基于AI的蛋白质结构预测的最新发展，如AlphaFold 3。多实体建模方法对于运动粒体蛋白质特别有用，其中许多蛋白质在运动粒体和相关的真核谱系中没有密切的同源物，限制了从传统比较结构生物学中推断[23]、[96]。这种多层次整合的分析支柱可能由新兴的生物基础模型提供，如KRONOS，它自动化地将跨平台的蛋白质组学、转录组学和结构证据合成到预测性互作组学图中[99]。通过将AlphaFold 3衍生的结构先验与SEC-MS物理约束和接近标记衍生的空间信息相结合，这些模型可以促进功能可解释的3D组装的重建，并能够识别可能代表候选治疗靶点的寄生虫特异性界面[21]、[29]。这一趋势的长期结果可能是出现一个交互式虚拟寄生虫框架，该框架可以模拟阶段特异性的互作组学重排、药物诱导的网络扰动和谱系解析的脆弱性特征[99]。然而，实现这样的图谱可能需要三个相互关联的优先事项的协调进展：（i）在内源标记方法在临床寄生虫分离物中的更广泛应用[12]、[21]；（ii）无文库DIA和空间接近标记工作流程的持续成熟和标准化，以便在运动粒体研究中常规使用[102]；（iii）扩展在寄生虫特异性数据集上训练的基础模型，以提高生物学相关性和预测性能[103]。9. 结论最近，在接近标记方面的发展通过提高标记速度、空间分辨率和实验灵活性，扩展了酶介导的互作组学的范围。然而，平台特定的限制表明，性能在不同生物系统中的表现仍然高度依赖于具体背景[12]、[98]。TurboID和miniTurbo被视为通过不依赖外源氧化底物的生物素依赖性催化作用恢复了与这些环境的兼容性，尽管残余的背景标记和非特异性生物素化仍被指为持续存在的问题[12]、[28]。几种下一代接近标记方法目前正在这种方法论框架的边缘出现，它们的分析贡献逐渐变得明显[12]。据报道，光接近标记可以实现毫秒级的时间分辨率，用于脉冲-追踪实验[115]，而PerTurboID被认为可以允许对互作组学动态进行扰动解析映射[27]。ipeAX被提出作为一种替代方法，通过酶级联反应产生的底物生产来避免对H2O2的依赖，从而可能扩展与氧化还原敏感系统的兼容性[26]。与此同时，使用同位素编码探针的超分辨率接近标记策略作为工具，可能实现接近纳米级的亚细胞器拓扑映射[28]。此外，包括ProtA-TurboID [117]和CAT-Prox [114]在内的抗体靶向策略已经开发出来，绕过了对稳定基因组工程的需求，为在基因难以操作或临床相关的分离物中实施提供了潜在有用的途径[12]。尽管这些新兴平台共同解决了传统基于酶的接近标记的主要限制，但大多数仍处于开发的早期阶段。它们的性能主要在概念验证研究中得到展示，而在各种细胞系统（尤其是非模型运动粒体）中的系统验证仍然受到限制。因此，它们在复杂生物学背景下的更广泛实用性、鲁棒性和可扩展性仍有待完全确立[12]。在这个领域中，运动粒体可能既是严格测试场，也是下一代接近标记方法的潜在高价值应用领域。光接近标记可能适用于基体复制和kDNA分离事件，尽管迄今为止尚未在运动粒体系统中直接展示[12]、[115]。ipeAX可能有望解决历史上限制APEX工作流程在运动粒体细胞质中常规使用的巯基硫醇相关氧化还原限制；然而，这一假设仍有待实验验证[6]、[14]、[26]。像ProtA-TurboID [117]和immunoPL工作流程 [12]、[113]这样的抗体靶向平台可能会将接近互作组学的应用扩展到难以稳定基因组整合的临床分离物[3]。然而，在血液形式的T. brucei中，密集的VSG可能会限制抗体的可及性，需要额外的方法学调整[6]、[69]、[118]、[119]。虽然新兴的接近标记策略解决了抗拒稳定基因组整合的分离物问题，但在适合内源基因组编辑的系统中，CRISPR–Cas9标记已用于L. donovani和T. cruzi，结合SEC-MS组装了分别包含16,095个和>16,000个相互作用的基因组级物理相互作用支架[21]、[22]。这些无标签的互作组学基准不仅作为验证工具，还通过细化诱饵-猎物关系和支持在结构化网络框架内优先排序候选相互作用。XL-MS提供了实验衍生的残基级距离限制，并在原生动物系统中显示出适用性[108]，而AlphaFold 3使得缺乏密切相关结构模板的蛋白质复合物的残基解析建模成为可能[29]。然而，它们在高度多样化的Discoba蛋白质组上的表现仍有待系统评估，需要在更广泛的自动化互作组学重建工作流程中之前进行严格的基准测试[96]。展望未来，无文库DIA工作流程和AI辅助的结构建模的发展可能会使寄生虫学中的空间蛋白质组学从主要描述性研究转向更具预测性和系统导向的分析[98]、[120]。像KRONOS这样的多模态基础模型可以为结合多层次蛋白质组学数据集和计算机模拟的寄生虫表示提供框架，可能有助于阶段特异性脆弱性映射和优先识别与宿主蛋白质相似性有限的必要寄生虫靶点，前提是空间、物理和结构数据集继续改进[99]。尽管如此，运动粒体互作组学的最紧迫优先事项是标准化和重复现有接近标记工作流程，然后是系统性的正交基准测试和高度可信候选者的实验验证。标准化应包括标记持续时间、生物素浓度、发育阶段的优化和一致定义，以及适当的匹配对照，以减少背景并提高不同寄生虫系统之间的可比性[35]、[61]、[66]、[99]。随后，将接近标记数据集与SEC-MS和XL-MS结合应有助于区分空间接近性和天然分子关联的证据，并为评估候选相互作用提供额外的结构约束[21]、[22]、[99]、[106]、[107]、[108]。然后，可以通过定位研究、遗传扰动或补充的生化策略，优先验证这些独立证据层支持的候选者，特别是对于运动粒体暗蛋白质组中特征不明确的蛋白质[13]、[21]、[70]、[71]。尽管存在技术和生物学上的限制，空间蛋白质组学、定量互作组学、结构生物学和机器学习的集成实施可能会扩展运动粒体研究的分析范围。对于寄生虫学家来说，这些发展为研究特定谱系的细胞器、发育转换和支撑寄生虫适应的广泛暗蛋白质组提供了新的机会。对于蛋白质组学界来说，运动粒体为评估新兴互作组学技术提供了一个独特具有挑战性的框架，这些技术应用于高度区室化的细胞结构和系统发育上不同的蛋白质组。在这个背景下，运动质体互作组学的未来发展不仅仅依赖于引入更多基于邻近性的标记技术，还需要一个分阶段的框架：首先将现有的邻近性标记工作流程标准化；接着根据正交的物理和结构证据对潜在的关联进行评估；最后对高可信度的候选关联进行有针对性的实验验证。随后可以有选择地应用新兴技术，如条件性光邻近性标记、氧化还原兼容性标记、抗体导向标记以及人工智能辅助的方法，以解决这些基础工作流程中尚未解决的问题。这种优先级的处理方法有助于从描述性的邻近性图谱向可重复的、具有机制解释能力的模型过渡，最终实现寄生虫生物学的预测性研究。

**CRediT 作者贡献声明**
**An?l Ata**：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，监督，研究，概念化。
**Derya Topuz Ata**：撰写 – 审稿与编辑，概念化。
**Zeynep Tuba Odac?**：可视化，研究。

**伦理批准与参与同意**
不适用。

**资金支持**
作者在完成这项工作过程中未获得任何组织的资助。

**作者信息**
An?l Ata | Derya Topuz Ata | Zeynep Tuba Odac?