整合空间与单细胞转录组揭示结直肠癌中IFI6+调节性T细胞与SPP1+巨噬细胞的免疫抑制微环境

《British Journal of Cancer》：Integrated spatial and single-cell transcriptomics uncover IFI6? regulatory T-cells and SPP1? macrophages immunosuppressive niches in colorectal cancer

背景：在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中，肿瘤-免疫相互作用是肿瘤发生、免疫逃逸和治疗应答的关键驱动因素。因此，迫切需要更深入的空间分辨研究来理解这些相互作用。 方法：研究人员利用结直肠癌及配对正常样本的空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）技术，表征与肿瘤发生和免疫浸润相关的细胞群体及基因表达模式。此外，还分析了来自472例和617例结直肠癌患者的41张公开可用的空间转录组切片、单细胞转录组学及 bulk 转录组学数据集，以验证研究结果。 结果：肿瘤区域表现出深刻的分子改变，包括致癌通路、免疫抑制因子增加，以及通过犬尿氨酸酶-芳香烃受体（KYNU-AHR）轴介导的色氨酸剥夺，诱导巨噬细胞趋化因子CXCL5，从而促进免疫逃逸。在肿瘤边界，SPP1+巨噬细胞通过CCL18-CCR8和CCL22-CCR4趋化因子信号招募调节性T细胞（regulatory T-cells, Tregs），构建免疫抑制微环境。SIT1被揭示为三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures, TLSs）内潜在的抗肿瘤T细胞抑制因子，提示一种新的免疫调节机制。研究人员还发现了一个此前未表征的肿瘤浸润性IFI6+ Treg细胞群体，该群体以干扰素相关基因和潜在免疫检查点靶点LGALS9高表达为特征，并与不良预后和治疗应答相关。 结论：本研究揭示了此前未被识别的免疫抑制细胞群体和关键免疫调节因子，推进了对结直肠癌免疫逃逸机制的理解，并为个性化免疫治疗提供了潜在靶点。

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一、研究背景与科学问题

结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，2020年新发病例近200万，死亡人数约100万，居癌症相关死亡原因第二位。预计到2040年，新发病例和死亡人数将分别增至320万和160万。尽管免疫治疗取得了巨大进展，转移性结直肠癌的5年生存率仍仅约14%。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）在结直肠癌中是一个高度复杂且异质的生态系统，包含T细胞、巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cells, DCs）和癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）等多种细胞类型，这些细胞通常通过肿瘤来源的信号被招募。在TME内，癌细胞与免疫细胞之间的持续相互作用促成了免疫抑制环境的建立，从而促进肿瘤进展并介导免疫逃逸。

在免疫抑制细胞中，M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）在结直肠微环境中发挥关键的促肿瘤作用，通过分泌生长因子、基质金属蛋白酶或IL4、IL10等抗炎细胞因子，促进上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）、刺激血管生成并抑制抗肿瘤活性。调节性T细胞（Tregs）是结直肠癌免疫逃逸的主要调控者，具有多种免疫抑制功能，并与结直肠癌的不良预后相关。重要的是，M2型TAMs可诱导Tregs生成以促进肿瘤发展，强化免疫抑制环境。

单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）彻底改变了对TME异质性的详细表征，但单细胞技术需要组织解离，导致空间背景不可逆地丢失。近年来，空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）作为理解基因表达空间模式和细胞-细胞相互作用的关键技术而发展起来，尤其是对于TME表征。然而，目前对结直肠癌中免疫抑制性细胞群体及其空间协调机制的认识仍不完整，迫切需要更深层次的空间分辨研究来揭示这些复杂的细胞互作网络及其潜在分子机制，这对于开发有效的免疫治疗策略至关重要。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员对一名63岁女性G2期无转移结肠癌患者的肿瘤及配对正常组织进行了空间转录组学分析，并整合了公开数据集进行验证，包括41张含临床信息的ST切片（最终纳入31张：1例健康对照、10例早期和15例晚期结直肠癌）、代表472例结直肠癌患者的scRNA-seq数据集以及617例患者的bulk转录组学数据集。

主要技术方法包括：使用Seurat进行数据整合、降维和聚类分析；通过差异基因表达分析和基于GO-BP数据库的pathfindR通路富集分析；采用SpaCET和RCTD进行细胞类型斑点去卷积；利用NICHES结合Fantom5和Omnipath数据库进行配体-受体（ligand-receptor, L-R）相互作用分析；使用STdeconvolve进行无参考去卷积及SPATA2进行侵袭性空间轨迹分析；应用Monocle3和TradeSeq进行拟时轨迹分析；利用LIANA推断细胞间相互作用；通过TCGA数据结合CIBERSORT进行生存分析。

三、主要研究结果

1. 结直肠癌空间细胞组成与TME异质性表征

通过对结直肠癌肿瘤及配对正常组织进行空间转录组学分析，研究人员手动注释了上皮/肿瘤、基质、内皮、肌肉和免疫细胞（immune cell, IC）聚集区域。聚类分析产生19个簇，肿瘤簇（Tumor_1、Tumor_2、Tumor_3和干样簇）突破注释边界延伸至周围基质。Tumor_1具有最高转录活性，被指定为肿瘤核心。细胞类型去卷积鉴定出五种主要细胞类型，NK细胞和肥大细胞在肿瘤区域几乎不存在。无参考STdeconvolve去卷积显示肿瘤主题（S100A6、S100A4、MMPs、EPCAM、CDH1和CD44）侵入基质，表明空间复杂性高于ST斑点分辨率所观察到的水平。免疫去卷积分数显示肿瘤内高免疫浸润，肿瘤浸润T细胞局限于肿瘤簇，提示活跃的癌症-T细胞通讯。

2. 肿瘤簇转录组谱揭示EMT和免疫抑制TME特征

肿瘤簇与正常上皮对应物的差异基因表达分析显示，肿瘤核心Tumor_1含有最多差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。所有肿瘤簇均富集整合素介导的信号、细胞黏附、细胞迁移、Wnt信号负调控及EMT正调控等通路。沿侵袭轨迹（Tumor_1/Tumor_2/Tumor_3），癌症干细胞标志物CD44、增殖相关基因KLK10、TNF相关基因、趋化因子（CCL18和CCL22）、金属蛋白酶（MMP2、MMP9、MMP11）及干扰素诱导基因IFI6上调，而肠道完整性相关基因下调。所有肿瘤簇均检测到免疫抑制因子TGFB1、TGFB1I1及抑制性免疫检查点CD276升高，表明免疫抑制性TME。肿瘤簇还表现出与色氨酸代谢剥夺相关的免疫抑制，以AHR表达升高和Tumor_2中KYNU选择性表达为特征。配体-受体相互作用分析揭示了CCL18-PITPNM3相互作用、CD24-SIGLEC10“别吃我”信号及DPP4-趋化因子和CCL28-CCR10相互作用。公共ST数据验证了CD44、KYNU-AHR通路、CD47和CXCL5在结直肠癌中的高表达。

3. 浸润T细胞和髓系细胞亚群的深入探索

SPP1⁺巨噬细胞在肿瘤周围形成“屏障样”环状结构，呈现免疫抑制性M2样表型。肿瘤巨噬细胞簇中SPP1、MHCII基因、载脂蛋白APOE和APOD及CCL18、CCL22、CD276上调，支持免疫抑制表型。L-R分析显示活跃的抗原呈递及增加的金属蛋白酶和细胞-细胞/细胞-基质黏附，提示巨噬细胞参与支持癌症侵袭的细胞外基质重塑。LAIR1（巨噬细胞和T细胞抑制因子）在肿瘤-基质界面表达升高，反映该边界的免疫抑制微环境。FAP⁺ CAFs在侵袭轨迹末端丰度最高，以高ECM重塑为特征。Treg细胞群主要预测在肿瘤核心内，而初始T细胞主要在正常组织的IC聚集中。SPP1⁺巨噬细胞-Treg细胞邻域主要定位于结直肠癌肿瘤的侵袭边缘。肿瘤IC聚集中确认了T细胞归巢和TLS形成（CXCL13-CXCR5、CCL19-CCR7、CCL21-CCR7）、TCR信号、T细胞活化及抗原呈递。尽管TLS形成通常与良好预后相关，但也发现局部免疫抑制信号PVR-TIGIT和PVR-CD96增加，以及可能影响Bregs-Tregs稳态的CD72-CD5相互作用和CCL22-CCR4、CCL5-CCR4、CXCL12-CCR4介导的CCR4⁺ Tregs向TLS招募。

4. 拟时分析揭示SIT1改变结直肠癌TLSs中的T细胞信号

对从正常淋巴腺到肿瘤TLSs的免疫细胞进行拟时轨迹分析，揭示两个发育谱系。与“正常谱系”相比，“肿瘤谱系”含有更高的抗菌LTF、炎症相关基因（S100A9）、补体级联（C1R、C1S、C3）、先天免疫（LSM14A）、细胞毒性相关基因（GZMB和CLEC4A）、活跃的MHCI和MHCII抗原呈递及CD81表达。同时，肿瘤谱系显示共刺激CD28减少，SIRT2和负性TCR调节因子SIT1增加，表明T细胞信号受损。L-R分析结合拟时轨迹建模显示CXCL12相互作用增强和血管化增加。这些发现提示，尽管TLSs中存在活跃的免疫应答，但SIT1作为潜在的新型调节因子改变了结直肠TME中TLSs内的T细胞活化。

5. IFI6⁺ Tregs作为结直肠TME中潜在的新型Treg亚群

对肿瘤不同簇中FOXP3⁺斑点进行差异表达分析，发现干扰素相关基因（IFI6和ISG15）和趋化因子（CXCL8和CXCL5）在Tumor_2簇浸润的Tregs中高表达。公共scRNA-seq数据集验证了IFI6在肿瘤和转移性Tregs中高表达。进一步Treg聚类分析揭示IFI6⁺ Treg亚群比例在结直肠癌肿瘤和转移中显著增加，并贯穿CRC进展各阶段。该亚群高表达其他干扰素相关基因（ISG15、IFIT1、IFIT3、IFI44、IFITM1、IFI16、IFIH1、IFITM3、IFITM2）以及LAP3和LGALS9。重要的是，该亚群比例在治疗无应答者中显著增加，生存分析显示其与生存概率显著降低相关。细胞间相互作用分析显示，IFI6⁺ Tregs可能通过CCL20-CCR6、TFF3-CXCR4、CXCL16-CXCR6、CXCL13-CXCR3和CXCL14-CXCR4等相互作用被招募，并通过CD86-CD28和CD86-CTLA4信号与cDC相互作用促进免疫抑制，通过MHCI呈递肿瘤抗原和HLA-E-KLRD1免疫检查点抑制CD8⁺ T细胞、γδ T细胞和NK细胞。

四、讨论与结论

讨论部分指出，结直肠TME富集多种免疫抑制信号通路，肿瘤核心被SPP1⁺巨噬细胞包围并伴有Tregs浸润。在结直肠癌侵袭中，CCL18发挥双重促肿瘤作用，通过CCR8诱导EMT和招募Tregs，与CCL22-CCR4协同。研究人员还识别出TLSs中通过SIT1介导的此前未被认识的T细胞信号受损，以及结直肠癌中活化的IFI6⁺ Treg群体，并在独立公共队列中验证。该研究建立了进一步功能研究的基础，最终将促进治疗结直肠癌的新治疗策略的开发。

研究结论为：结直肠TME富含不同的免疫抑制信号通路，肿瘤核心被SPP1⁺巨噬细胞包围并伴有Tregs浸润。在结直肠癌侵袭中，CCL18通过CCR8发挥双重促肿瘤作用，诱导EMT和招募Tregs，与CCL22-CCR4协同作用。同时，研究人员在TLSs中识别出通过SIT1介导的此前未被认识的T细胞信号受损，以及在结直肠癌中发现并独立公共队列验证的活化IFI6⁺ Treg群体。本研究为进一步功能研究奠定基础，并最终促进治疗结直肠癌的新治疗策略的开发。