《Journal of Virological Methods》：A double-antibody sandwich ELISA based on nanobody against the viral spike protein detects porcine epidemic diarrhea virus
编辑推荐：
•建立了一种新型S蛋白双抗体夹心ELISA用于PEDV检测。•该方法有效避免了传统N蛋白检测系统与PDCoV等相关冠状病毒之间的交叉反应，实现了高特异性鉴别诊断。•分子对接首次揭示Nb9识别由S1远端环区与S2细胞外卷曲基序组成的不连续构象表位，且与靶向S1/S2线性表位的兔
- •
建立了一种新型S蛋白双抗体夹心ELISA用于PEDV检测。
- •
该方法有效避免了传统N蛋白检测系统与PDCoV等相关冠状病毒之间的交叉反应，实现了高特异性鉴别诊断。
- •
分子对接首次揭示Nb9识别由S1远端环区与S2细胞外卷曲基序组成的不连续构象表位，且与靶向S1/S2线性表位的兔多克隆抗体之间不存在空间位阻竞争，为其优异的配对效率提供了结构基础。
引言
猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科。该病毒主要在小肠绒毛上皮细胞中复制，引起以腹泻、呕吐和脱水为特征的肠道疾病，且在哺乳期仔猪中具有高致死率（Stevenson等，2013）。PEDV最早于20世纪70年代在比利时被发现，随后逐渐传播至欧洲和亚洲的许多国家（Pensaert和de Bouck，1978）。在中国，PEDV于2010年首次在南方的地区暴发，并迅速蔓延至全国大多数养猪场（Li等，2023a）。此后，包括美国和加拿大在内的34个国家均报告了PEDV感染病例，这已成为全球养猪业面临的最重要疾病之一（Su等，2018）。
PEDV是一种具有包膜结构的单股正义RNA病毒。其基因组长度约为28 kb，包含至少七个开放阅读框，编码复制酶多聚蛋白和四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。根据基因组序列差异，PEDV分离株可分为两种基因型：G1和G2。G1代表株为CV777，G2代表株为LNCT2（Chen等，2013，Lee和Lee，2014，Liu等，2017）。研究表明，G1基因型可进一步细分为两个亚型：G1a和G1b。基于对409株PEDV完整基因组序列的系统发育分析，G2基因型被分为三个亚型：G2a、G2b和G2c（Guo等，2019）。G1与G2株的差异主要集中在S蛋白编码区。与原型株CV777相比，大多数G2株在S基因中存在九核苷酸插入（相当于三个氨基酸），且S基因中存在多处插入、缺失及其他位点突变（Lee和Lee，2014）。根据与其他冠状病毒S蛋白的同源性比较，S基因被分为两个功能结构域：S1和S2（Wang等，2016）。
重链抗体（VHH）的重链可变区也称为"纳米抗体"（Nb）。它是一种缺乏轻链的天然重链抗体可变区片段，分子量约为15 kDa，是目前已知最小的功能性抗原结合片段（Zavrtanik等，2018）。与传统的单克隆抗体相比，纳米抗体具有分子量低、对抗原亲和力强、表达量高且非常稳定等特点，在疾病诊断和治疗的许多方面发挥着重要作用（Zhang等，2025）。噬菌体展示技术是一种高效筛选特异性抗体的方法（Sheng等，2019），具有操作简便、筛选效率高、特异性噬菌体快速富集等优势。抗体基因与噬菌体衣壳蛋白融合，实现"表型-基因型"偶联，便于筛选针对特定抗原的高亲和力抗体片段（Lafaye和Li，2018）。
目前，实验室检测PEDV抗原的方法主要分为两大类。一类为直接检测技术，包括病毒分离（Guscetti等，1998）和酶联免疫吸附测定（ELISA）（Klasse，2014），用于直接检测PEDV病毒颗粒或其抗原组分。另一类为分子生物学检测方法，如逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）（Wang等，2014）、多重PCR（Huang等，2019）、实时荧光定量PCR（qPCR）（Tsai等，2012）和环介导等温扩增（LAMP）（Notomi等，2015），主要用于检测PEDV的遗传物质。在这些方法中，ELISA因其通量高、操作简便、对大型仪器设备依赖度低且成本相对较低等优势，被广泛用于PEDV的快速筛查（Diel等，2016）。因此，为建立一种成本有限且便于在基层对大规模临床样本进行分析的方法，我们构建了一种双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）。该方法以兔源多克隆抗体（pAbs）作为捕获抗体，纳米抗体（Nb）作为检测抗体，可有效检测PEDV抗原及感染组织样本。该方法表现出优异的 specificity、敏感性和重复性，适用于PEDV的临床检测和监测。
章节摘要
材料
PEDV株CH/HBXT/2018（Zhang等，2019）保存在我们的实验室中。靶向PEDV S蛋白的纳米抗体（Nb）此前已在我们的实验室中完成筛选和制备。Vero细胞购自美国模式培养物收藏中心（ATCC编号CCL-81）。pCDNA3.1(+)真核表达载体购自Takara Bio（北京）。感受态大肠杆菌 BL21(DE3)细胞购自北京智门生物技术有限公司。辣根过氧化物酶
PEDV RBD和S2蛋白片段的表达纯化及pAbs的制备
PEDV RBD和S2蛋白片段在ExpiCHO细胞中成功表达。蛋白免疫印迹显示表达片段表现为约52 kDa和50 kDa的两条条带，条带大小与预期一致（图1A）。将上清液与Ni-NTA琼脂糖凝胶结合进行纯化。SDS-PAGE显示PEDV RBD和S2蛋白片段的表达和纯化成功（图1B）。为制备抗PEDV RBD和S2片段的抗体，每批次纯化后的
讨论
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高致病性的肠道冠状病毒，在全球范围内分布广泛，主要通过粪-口途径传播。感染会引起母猪严重腹泻和脱水，且在新生仔猪出生后一周内致死率接近100%（Jung等，2020，Kim等，2017）（Tian等，2025）。自2010年变异PEDV株大规模暴发以来，该病毒在全球猪群中持续存在，造成了大量
伦理声明
本研究严格按照以下动物福利和/或报告准则进行：《中华人民共和国动物伦理程序与准则》。本研究经中国农业科学院兰州兽医研究所动物管理与伦理委员会批准（批准号：LVRIAEC-2026-07-006）。
伦理声明
所有动物均严格按照《中华人民共和国动物伦理程序与准则》中的良好动物实践进行处理，本研究经中国农业科学院兰州兽医研究所动物管理与伦理委员会批准（许可号：LVRIAEC-2026-07-006）。
CRediT作者贡献声明
周鹏：资源、方法论、调查研究、正式分析。张忠旺：监督指导、方法论、正式分析、数据管理。张利萍：资源、项目管理、方法论、正式分析、数据管理。刘信生：写作-审稿与编辑、资源、方法论、调查研究、经费获取、数据管理、概念构思。余瑞明：验证、监督指导、调查研究、概念构思。李秀英：方法论、调查研究、正式分析。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究得到了甘肃省联合研究基金（项目编号：25JRRA1086）、甘肃省重大科技项目（项目编号：24ZD13NA008和23ZDNA007）、国家生猪技术创新中心（NCTIP-XD/C 03）、中国农业科研体系（项目编号：CARS-35）以及青海省科技计划项目（项目编号：2026-NK-117）的资助。
作者贡献
X.L.设计和构思了本工作。D.W.、L.Z.、R.Y.、Z.Z.、P.Z.、X.L.、X.L.、J.J.和C.S.
王东升|余瑞明|张利萍|张忠旺|周鹏|郭惠晨|李秀英|Xi Lan|宋昌芳|鞠金玲|潘丽|王翼平|刘信生
