《Immunity, Inflammation and Disease》：TGF-β/Smad-Associated Epithelial–Fibroblast Remodeling Underlies Collagen Deposition in Chronic Rhinosinusitis With Nasal Polyps
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背景：慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）常伴随上皮屏障破坏和组织重塑。本研究旨在探究上皮–间充质转化（EMT）、成纤维细胞活化、胶原沉积以及转化生长因子β（TGF-β）/Smad信号在CRSwNP鼻黏膜重塑过程中是否协同发生。材料与方法：整合来自两个独立人类队
背景：慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）常伴随上皮屏障破坏和组织重塑。本研究旨在探究上皮–间充质转化（EMT）、成纤维细胞活化、胶原沉积以及转化生长因子β（TGF-β）/Smad信号在CRSwNP鼻黏膜重塑过程中是否协同发生。材料与方法：整合来自两个独立人类队列的公开单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，以表征上皮、成纤维细胞和髓系异质性、疾病相关转录变化、拟时序动态及细胞间通讯，并应用CellChat分析COLLAGEN和TGF-β信号模块。对CRSwNP患者鼻息肉和对照鼻黏膜进行免疫荧光、Masson三色染色和过碘酸–希夫（PAS）染色。采用卵清蛋白（OVA）/金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）诱导的CRSwNP样小鼠模型，包括地塞米松干预组，进行组织病理学、免疫荧光和Western blot验证。结果：在CRSwNP中，成纤维细胞向活化、基质重塑状态转变，上皮细胞显示增强的损伤–修复和EMT相关特征，而TGFB1优先在鼻息肉中扩增的GPNMB表达巨噬细胞亚群中检测到。潜在的上皮–成纤维细胞通讯在COLLAGEN和TGF-β模块中富集，TGFB1–TGFBR1/TGFBR2和COL1A1–SDC4/CD44成为候选配体–受体对。人鼻息肉显示胶原沉积、α-SMA高表达成纤维细胞富集、EMT样上皮变化和核内p-Smad3积累。小鼠模型重现该模式，地塞米松在蛋白质水平部分逆转该模式。讨论：整合人类单细胞转录组学与组织及蛋白质水平验证，本研究描述了一个协调的、TGF-β/Smad3相关的上皮–成纤维细胞重塑程序，其是CRSwNP胶原沉积的基础。这些候选轴，连同巨噬细胞来源的TGFB1，为上皮–成纤维细胞–免疫串扰提供机制线索；地塞米松的部分可逆性支持通路靶向抗重塑策略，但因果关系仍待空间和功能验证。
慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是慢性鼻窦炎（CRS）的一种临床表型，具有较高的复发倾向和治疗反应异质性，其病理基础不仅包括持续炎症，还包括鼻黏膜屏障功能受损、水肿和息肉样增生。长期炎症刺激和反复损伤–修复循环可驱动鼻黏膜结构重塑，进而促进CRSwNP的慢性进展、治疗抵抗和术后复发。鼻黏膜重塑过程中，上皮细胞、基质细胞、浸润免疫细胞和细胞外基质（ECM）共同构成动态局部病理微环境。上皮细胞维持黏膜屏障，并在炎症刺激和损伤修复中获得一定表型可塑性；成纤维细胞是ECM沉积和黏膜结构重塑的重要贡献者，胶原沉积是ECM重塑和基质重塑的重要表现。微生物超抗原相关刺激，如金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB），与CRSwNP黏膜炎症和息肉样病变形成有关；巨噬细胞和嗜酸性粒细胞被报道为慢性气道炎症中TGF-β1的重要细胞来源。TGF-β1和IL-1β与上皮损伤修复和EMT密切相关。既往研究发现鼻黏膜上皮屏障相关分子（E-cadherin、ZO-1、Occludin）表达降低，间充质标志（N-cadherin、Vimentin、α-SMA）表达升高，并提示TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路参与鼻黏膜EMT；COL1A1可通过Wnt/β-catenin信号调控鼻上皮EMT和炎症反应。尽管已有研究从单细胞亚群和上皮–基质相互作用角度揭示CRSwNP鼻黏膜重塑复杂性，但整体病理微环境中组织结构异常、细胞状态转换和细胞间通讯，包括免疫和基质区室对TGF-β1信号的相对贡献，仍研究不足。因此，研究人员整合公共单细胞转录组数据、手术切除人鼻标本和OVA/SEB诱导的CRSwNP样小鼠模型，探究鼻黏膜重塑中的上皮–基质协调，并将细胞状态转换和推断的细胞间通讯与转录组及蛋白水平的组织ECM改变相联系。研究得出结论：CRSwNP中存在一个TGF-β/Smad3相关的上皮–成纤维细胞重塑程序，其构成胶原沉积的基础；TGFB1–TGFBR1/TGFBR2和COL1A1–SDC4/CD44为候选配体–受体轴，GPNMB表达巨噬细胞状态是TGFB1的额外细胞来源，地塞米松可在体内部分逆转该重塑。该研究为上皮–成纤维细胞–免疫串扰提供机制线索，并支持通路靶向抗重塑策略，但因果关系仍待空间和功能验证。
关键技术方法概括：研究人员整合GEO公共scRNA-seq数据集GSE235711和GSE276503，排除CRSsNP后纳入41例CRSwNP样本和7例健康对照；采用Seurat、Harmony、DoubletFinder、decontX和UMAP进行质控、整合、聚类与注释；以FindAllMarkers筛选差异表达基因，clusterProfiler进行GO和KEGG富集，fgsea进行GSEA；以CytoTRACE2评估分化潜能，Monocle3重建拟时序；以CellChat基于CellChatDB.human分析细胞通讯。人类标本为CRSwNP患者鼻息肉3例和鼻中隔偏曲对照鼻黏膜3例；动物实验采用雌性BALB/c小鼠，建立OVA/SEB诱导的CRSwNP样模型并设地塞米松干预组，采用H&E、Sirius Red、TSA免疫荧光和Western blot验证。
研究结果：3.1 单细胞转录组学揭示鼻内组织主要细胞组成。通过整合公开scRNA-seq数据，研究人员在质控、预处理、无监督聚类和人工注释后鉴定出13个主要细胞群体，包括T细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、周细胞、髓系细胞、B细胞、肥大细胞、浆细胞、角质形成细胞、浆细胞样树突状细胞以及1型和2型经典树突状细胞；对照样本主要来自下鼻甲和筛窦黏膜，CRSwNP样本来自下鼻甲、中鼻甲、筛窦黏膜和鼻息肉，分析在整体鼻内组织微环境水平进行，并考虑组织来源异质性。3.2 CRSwNP中上皮和成纤维细胞亚群异质性。通过再聚类，上皮细胞分为13个亚群，成纤维细胞分为8个亚群；样本水平上，成纤维细胞中炎性CCL2+成纤维细胞增加、APOD+成纤维细胞减少，而TAGLN+肌成纤维细胞样和COL1A2+基质产生亚群组间相当；上皮区室变化更明显，CXCL8+炎性亚群和MUC5AC+杯状细胞扩增，FOXJ1+纤毛细胞减少，LTF+、KRT15+、COL17A1+亚群也差异显著；髓系再聚类得到5个巨噬细胞亚群，其中GPNMB+重塑状态共表达SPP1、TREM2和MMP9，TGFB1优先在该亚群检测到，且该亚群在CRSwNP中增多。3.3 CRSwNP上皮细胞和成纤维细胞表现出炎症激活和基质重塑特征。通过差异表达分析和GSEA，上皮中SERPINB4、KRT13、KRT15、COL17A1、MMP7和VIM上调，SCGB1A1、FOXJ1、BPIFA1和MUC5B下调；成纤维细胞中POSTN、CCL2、SERPINE1、COL1A2和SDC4上调，PI16、APOD、CXCL12、MFAP4和IGFBP7下调；上皮富集炎症反应、EMT、缺氧、上皮分化、ECM组织、TGF-β/WNT和氧化应激，成纤维细胞富集EMT、炎症反应、缺氧、胶原代谢和TGF-β产生，通路–基因网络显示IL6和SERPINE1等共享。3.4 CRSwNP组织微环境中的上皮EMT和成纤维细胞活化。通过Monocle3和CytoTRACE2，上皮轨迹从LTF/DMBT1/SERPINB4高表达细胞向FOXJ1+纤毛、SCGB1A1+/MUC5B+/MUC5AC+分泌–杯状及KRT15+/COL17A1+/KRT13+/CXCL8+/STMN1+损伤修复和重塑状态延伸；成纤维轨迹从CFD/APOD成纤维细胞向CXCL12+基质调节、COL1A2+ ECM重塑和TAGLN+/VIM+/CCL2+活化状态延伸；沿拟时序EPCAM和CDH1下降，KRT15和COL17A1增加，SERPINE1、CTGF、TGFBI晚期富集，SNAI2后期增加，成纤维细胞中APOD、CFD、PI16下降，POSTN、TAGLN、TPM2、MYL9增加，COL1A1、COL1A2、FN1中后期高表达，提示稳态特征丢失、基质重塑、成纤维细胞活化和EMT样上皮变化。3.5 CRSwNP中上皮、成纤维细胞和巨噬细胞亚群间预测的COLLAGEN和TGF-β配体–受体信号。通过CellChat，CRSwNP中相互作用数量、总体强度和重塑相关通路信息流增加，尤其COLLAGEN和TGF-β，以及LAMININ、FN1和PERIOSTIN；TAGLN+、COL1A2+和VIM+成纤维细胞贡献突出；胶原网络中COL1A1/COL1A2–CD44、–SDC4、–ITGA1/ITGB1、–ITGA2/ITGB1增强，TGF-β网络中TGFB1–TGFBR1/TGFBR2、TGFB1–ACVR1/TGFBR1和TGFB3–TGFBR1/TGFBR2为候选；GPNMB+巨噬细胞作为额外TGFB1发送者作用于成纤维细胞和上皮细胞。3.6 人鼻息肉中TGF-β/Smad相关上皮–成纤维细胞重塑的蛋白质水平证据。Masson三色染色显示息肉上皮下胶原沉积更致密，PAS显示杯状细胞增生更明显；双免疫荧光显示COL1A1和α-SMA增强，上皮核p-Smad3积累、E-cadherin减弱、N-cadherin增强、POSTN增强；连续切片显示p-Smad3富集上皮邻近COL1A1、α-SMA和POSTN富集基质，对照中COL1A1和POSTN形成紧密连续上皮下带，息肉中松散不连续并向固有层弥漫。3.7 OVA/SEB诱导小鼠CRSwNP样鼻黏膜病变和组织重塑。H&E显示CRSwNP小鼠呼吸上皮增厚、上皮连续性受损、息肉样突起和炎症细胞浸润，息肉样病变数量和上皮病理评分升高；Sirius Red和偏振光显示胶原沉积增加，提示模型重现息肉样炎症和胶原沉积。3.8 CRSwNP小鼠鼻黏膜TGF-β/Smad通路激活伴随成纤维细胞活化相关胶原沉积和上皮EMT增强。双免疫荧光显示α-SMA+细胞累积和COL1A1增加，上皮E-cadherin减少而核p-Smad3增加，N-cadherin和POSTN增强；α-SMA/COL1A1共定位Pearson系数无显著差异，提示二者反映相邻区域重塑而非严格共表达。3.9 地塞米松在蛋白质水平部分逆转TGF-β/Smad3相关重塑。Western blot显示CRSwNP中COL1A1、POSTN、N-cadherin和α-SMA增加，E-cadherin降低，p-Smad3/Smad3比值升高，总Smad3无差异；DEX处理后COL1A1、POSTN、N-cadherin和α-SMA降低，E-cadherin恢复，其中α-SMA和E-cadherin与对照无统计学差异，但COL1A1、POSTN和N-cadherin仍高于对照，p-Smad3/Smad3仅呈非显著下降趋势且仍高于对照，提示该重塑可被糖皮质激素部分逆转。
讨论部分总结：该研究将单细胞转录组揭示的上皮和成纤维细胞状态变化与人类鼻组织及CRSwNP样小鼠模型中的组织水平重塑相连接。上皮区室向基底样状态偏移，KRT15和COL17A1增加，SCGB1A1+俱乐细胞和FOXJ1+纤毛细胞减少，MUC5AC+分泌细胞扩增；成纤维细胞从APOD、CFD等稳态状态向CCL2、COL1A2等炎症和基质相关状态转变。CellChat提名COLLAGEN和TGF-β为候选双向轴，髓系亚聚类将TGFB1定位到GPNMB表达巨噬细胞状态。人息肉和动物模型均显示胶原沉积、α-SMA高表达活化成纤维细胞、EMT样上皮变化和核p-Smad3积累，地塞米松部分逆转。讨论同时指出局限：CellChat和轨迹分析为计算推断，需空间分辨和功能扰动验证；两个公共队列种族和内皮型背景不同，GSE235711来自北美队列且偏向2型炎症，GSE276503来自中国队列且以IL-1β相关髓系炎症为特征，未按鼻窦部位分层；嗜酸性粒细胞捕获不足，难以进行亚群分析；OVA/SEB模型偏2型嗜酸性背景，且未进行COL1A1敲低、TGF-β/Smad通路阻断或上皮–成纤维细胞共培养等因果实验。该研究以组织重塑为切入点，连接细胞状态改变与组织水平重塑病理，扩展了既往以免疫炎症和免疫–上皮互动为中心的单细胞研究视角，为理解鼻息肉难治、复发和结构持续提供线索，并为抗重塑治疗及通路阻断研究提供实验基础。
结论翻译：整合两个独立人类队列的单细胞转录组学与人类息肉组织及CRSwNP样小鼠模型的蛋白质水平验证，本研究表征了一个TGF-β/Smad3相关上皮–成纤维细胞重塑程序，其是CRSwNP胶原沉积的基础。在该程序中，基底偏移、EMT样上皮变化伴随成纤维细胞活化和胶原积累，两个区室均出现核p-Smad3激活，体内地塞米松部分逆转。细胞通讯分析指出双向COLLAGEN和TGF-β信号为候选细胞间轴，并识别GPNMB表达巨噬细胞状态为TGFB1的额外细胞来源。因此，上皮–成纤维细胞TGF-β/Smad3轴作为息肉重塑的跨队列特征和抗重塑干预的可处理方向，仍待空间和功能验证。
