METTL3通过m6A甲基化Nrf2 mRNA增强巨噬细胞胞葬作用缓解肝脓肿

《Immunity, Inflammation and Disease》：METTL3 Alleviates Liver Abscess by Enhancing Macrophage Efferocytosis via m6A Methylation of Nrf2 mRNA

摘要 背景：持续性炎症和巨噬细胞胞葬作用受损导致细菌性肝脓肿（BLA）期间的肝损伤。本研究旨在探讨METTL3是否通过m6A甲基化Nrf2 mRNA促进巨噬细胞胞葬作用从而缓解BLA。 材料与方法：研究人员在肺炎克雷伯菌诱导的BLA小鼠模型中过表达肝脏METTL3。评估了肝损伤、血清细胞因子水平、Nrf2信号通路、Nrf2 mRNA的m6A富集程度、TAM受体表达以及巨噬细胞相关的Mertk和Nrf2表达。进一步在脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中进行了Nrf2敲低拯救实验。 结果：METTL3过表达减少了肝脓肿形成和组织损伤，降低了血清白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，并增加了IL-10和转化生长因子β（TGF-β）水平。METTL3过表达还增强了Nrf2 mRNA的m6A富集，激活了Nrf2/HO-1信号通路，并在BLA肝组织中上调了胞葬作用相关受体MerTK、Tyro3和AXL。免疫荧光分析显示，肝巨噬细胞中MerTK和Nrf2的共表达增加。在RAW264.7细胞中，Nrf2敲低逆转了METTL3诱导的MerTK、Tyro3和AXL上调，以及CD86阳性细胞减少和CD206阳性细胞增加。 结论：这些发现表明，METTL3促进Nrf2 mRNA的m6A甲基化，激活Nrf2/TAM受体轴，增强巨噬细胞胞葬作用，并缓解BLA。

研究背景与科学问题

细菌性肝脓肿（Bacterial Liver Abscess, BLA）是一种严重的化脓性感染性疾病，其核心病理机制在于感染部位大量坏死细胞和病原体碎片未能被及时清除。这会触发过度且持续的炎症反应，加剧局部组织损伤，若干预不当甚至可导致腹膜炎和败血症等不可逆损害。目前的标准化治疗（抗生素和穿刺引流）虽能有效消除病原体和管理脓腔，但在调控机体固有的炎症消退能力方面效果有限。因此，深入探究肝脓肿炎症主动消退的细胞和分子机制具有重要临床意义。

在肝脓肿进展过程中，巨噬细胞的胞葬作用（Efferocytosis），即高效识别、吞噬并清除凋亡和坏死细胞的过程，是驱动炎症消退和组织重构的关键免疫调节枢纽。然而，在肝脓肿等高负荷感染和应激条件下，巨噬细胞胞葬功能常受抑制，导致坏死碎片堆积、炎症持续和组织损伤加重的恶性循环。因此，增强巨噬细胞的胞葬能力是促进肝脓肿病灶愈合的关键科学挑战。

核因子E2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2, Nrf2）作为细胞抗炎防御的核心转录因子，对维持巨噬细胞功能稳态和调控吞噬相关基因至关重要。但其在肝脓肿中控制Nrf2表达和活性的上游机制尚不明确。表观转录组学调控，特别是N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰，能在转录后水平精确快速地调控基因表达，在免疫细胞应激反应中发挥重要作用。作为真核mRNA最丰富的化学修饰，m⁶A主要由METTL3等甲基转移酶催化。然而，METTL3介导的Nrf2 mRNA m⁶A甲基化是否能调控Nrf2信号，从而成为肝脓肿感染应激下巨噬细胞胞葬作用的关键调控节点，尚待研究。

本研究旨在确定在细菌性肝脓肿动物模型中，METTL3介导的Nrf2 mRNA m⁶A甲基化是否是增强巨噬细胞胞葬作用和促进肝脓肿消退的关键机制。

主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术：

1. 1.
   动物模型构建：采用肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）肝内注射建立BLA小鼠模型（C57BL/6J小鼠，来源于江苏青龙山生物技术有限公司）。
2. 2.
   体内基因操作：通过尾静脉注射重组腺相关病毒（AAV）实现肝脏特异性METTL3过表达。
3. 3.
   分子与生化检测：运用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白表达；使用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量血清细胞因子；采用甲基化RNA免疫沉淀结合定量聚合酶链反应（MeRIP-qPCR）检测Nrf2 mRNA的m⁶A富集水平。
4. 4.
   细胞生物学实验：在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞系中进行METTL3过表达和Nrf2 siRNA敲低的联合处理，通过流式细胞术分析巨噬细胞极化标志物（CD86和CD206），并通过实时定量PCR和Western Blot验证基因和蛋白表达变化。

研究结果

3.1 METTL3减轻BLA小鼠的肝组织损伤

通过观察大体标本和HE染色病理切片发现，与对照组相比，BLA模型组小鼠肝脏出现多发局灶性白色圆形隆起及区域化脓，并伴有肝细胞坏死、炎症细胞浸润。而METTL3过表达组（BLA+OV-METTL3）的肝脏病变数量显著减少，组织损伤明显减轻。

3.2 METTL3抑制BLA小鼠促炎反应并促进抗炎细胞因子产生

血清ELISA结果显示，与对照组相比，BLA模型组的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高。与空载体对照组（BLA+OV-NC）相比，METTL3过表达组不仅显著降低了这三种促炎因子的水平，还显著提高了抗炎/修复相关细胞因子IL-10和TGF-β的水平。

3.3 METTL3激活BLA小鼠肝脏Nrf2信号并增加Nrf2 mRNA的m⁶A富集

Western Blot结果表明，METTL3过表达进一步增强了BLA模型中Nrf2及其下游HO-1的蛋白表达，并更显著地抑制了负调控因子Keap-1的表达。同时，MeRIP-qPCR检测证实，METTL3过表达显著提高了Nrf2 mRNA上的m⁶A修饰富集水平。

3.4 METTL3促进BLA小鼠巨噬细胞胞葬作用并上调TAM受体

Western Blot分析显示，METTL3过表达显著上调了BLA肝脏组织中胞葬相关TAM受体（MerTK、Tyro3和AXL）的蛋白水平。三重免疫荧光染色进一步揭示，在METTL3过表达组的肝脏巨噬细胞（F4/80⁺）中，MerTK和Nrf2的共表达显著增加，将Nrf2激活与MerTK介导的胞葬作用联系起来。

3.5 Nrf2敲低逆转LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中METTL3诱导的TAM受体上调

在体外实验中，与对照相比，METTL3过表达显著增加了LPS刺激的RAW264.7细胞中MerTK、Tyro3和AXL的mRNA和蛋白水平。而在此基础上进行Nrf2敲低，则能显著逆转METTL3过表达引起的这三种TAM受体的上调，证实Nrf2是METTL3调控TAM受体的关键下游介质。

3.6 Nrf2介导LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中METTL3诱导的抗炎巨噬细胞极化

流式细胞术分析表明，METTL3过表达显著降低了促炎表型标志物CD86阳性巨噬细胞的比例，并增加了抗炎/修复表型标志物CD206阳性巨噬细胞的比例。Nrf2敲低则显著阻断了METTL3过表达引起的这种表型转换，证明METTL3通过Nrf2促进巨噬细胞向抗炎和促修复表型极化。

讨论总结与研究结论

讨论总结：该研究证实了METTL3/Nrf2轴是协调BLA期间巨噬细胞胞葬作用、炎症消退和组织修复的核心机制。在肺炎克雷伯菌诱导的BLA模型中，肝脏METTL3过表达能显著减轻肝组织损伤，重塑细胞因子谱（降低促炎因子，升高抗炎因子）。其分子机制是通过增加Nrf2 mRNA的m⁶A甲基化修饰，激活Nrf2/HO-1信号通路，进而上调胞葬作用关键TAM受体（MerTK, Tyro3, AXL）的表达，并促进巨噬细胞向抗炎修复表型极化。体外RAW264.7细胞的Nrf2敲低拯救实验证实了Nrf2在此过程中的因果作用。研究指出，METTL3在BLA中可能扮演早期代偿性保护角色，而其过表达则发挥治疗性抗炎效应。此外，研究也承认了其局限性，包括使用非巨噬细胞特异性AAV载体、未在原发性库普弗细胞中验证、未直接检测凋亡细胞吞噬及Nrf2与TAM受体启动子的结合等，建议未来研究采用巨噬细胞特异性遗传模型和更直接的分子生物学方法进行深入探索。

研究结论翻译：本研究的结果表明，METTL3通过促进Nrf2 mRNA的m⁶A甲基化和激活Nrf2/HO-1信号通路，来缓解肺炎克雷伯菌诱导的BLA。Nrf2的激活上调了TAM受体MerTK、Tyro3和AXL，并促进了巨噬细胞向抗炎和促修复表型的极化，从而增强了胞葬作用并加速了炎症消退。在RAW264.7巨噬细胞中，Nrf2敲低逆转了这些分子和表型变化，这证实了Nrf2是METTL3的关键下游介质，并确立了METTL3/Nrf2轴作为BLA中的一个重要调控通路。