β细胞应激驱动表位多样化：翻译后修饰抗原在1型糖尿病中的作用

《Immunological Reviews》：Beta Cell Stress to Epitope Diversification: Post-Translationally Modified Antigens in Type 1 Diabetes

　　

胰腺β细胞是免疫耐受丧失的主动参与者，其高分泌需求使其对炎症暴露、内质网（ER）应激、钙稳态失调和氧化还原失衡具有特殊易感性。这些条件可促进自身蛋白发生酶促和非酶促改变，产生在免疫耐受建立期间缺失或代表性不足的翻译后修饰（PTM）抗原和新表位。本综述整合了1型糖尿病（T1D）领域的相关研究，探讨β细胞应激、转谷氨酰胺酶2（TGM2）依赖性反应、肽酰精氨酸脱亚胺酶介导的瓜氨酸化、氧化修饰及翻译后肽段融合如何重塑抗原景观。研究人员考虑了这些产物如何改变抗原呈递及自身反应性T细胞的识别，以及不断演化的新表位库如何促进抗原多样化和表位扩展。重要的是，新决定簇的克隆募集必须与T细胞受体（TCR）交叉反应性、双TCR表达、旁观者激活或组织再分布所导致的表观性拓宽相区分。明确修饰表位何时产生、哪些表位被天然呈递、以及哪些应答参与发病机制，有助于改进生物标志物开发、患者分层和治疗策略，旨在减轻β细胞应激，从而增强其存活和身份维持，同时恢复免疫耐受。

论文主体内容总结

1 引言

阐明自身反应性识别如何逐步拓宽，对于理解慢性免疫相关疾病的进展至关重要。在T1D患者中，遗传易感性对环境暴露和胰腺β细胞应激的异质性汇聚，可破坏免疫耐受并促进针对胰岛素产生细胞的CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答。疾病进展不仅取决于启动胰岛炎症的免疫应答，还取决于持续的β细胞损伤如何改变可供识别的抗原并募集或扩增额外的自身反应性应答。自身反应性免疫识别进展的重要特征之一，是免疫应答从初始决定簇向同一蛋白内或同一靶组织不同蛋白上的额外表位多样化。分子内表位扩展指识别扩展至同一蛋白内的新决定簇，而分子间表位扩展涉及同一组织或抗原复合物内不同蛋白来源的决定簇。经典表位扩展通常意味着具有额外抗原特异性的淋巴细胞克隆的募集或扩增，需与TCR交叉反应性、双TCR表达、旁观者激活或组织再分布相区分。在自身免疫中，靶组织无法被清除而不持续补充维持应答的自身抗原，因此表位扩展可能变得自我延续而非自我限制。这一区别在T1D中尤为重要，因为自身反应性淋巴细胞从受损β细胞释放天然蛋白、隔离物质和展示不足的决定簇。APC在炎症环境中获取这些抗原，细胞因子暴露可改变蛋白水解、ER应激和氧化还原失衡，从而影响抗原加工和结构。β细胞应激依赖性抗原的出现也暴露了免疫耐受的重要局限性，因为中枢耐受主要针对胸腺中发育淋巴细胞可获得的自身抗原和肽段结构而建立。应激β细胞随后可产生在耐受性库中缺失或代表性不足的肽段组合或加工副产物。PTM是蛋白质合成后发生的共价化学改变，可影响蛋白质折叠、蛋白水解、MHC结合或受体识别。新表位是相对于生理性抗原库新产生或显著改变、因此在耐受建立期间未得到有效代表的抗原决定簇。杂交胰岛素肽（HIP）是T1D中一类重要的新表位，由蛋白水解产生的胰岛素或前胰岛素衍生片段通过新肽键与另一源自胰岛素或β细胞分泌颗粒蛋白的肽段共价连接而成。遗传易感性也决定了这一变化抗原库的哪些组分被展示给T细胞。在NOD小鼠中，I-A^g7在功能上类似于人类T1D主要风险分子HLA-DQ8，其共享的肽结合特征可支持非常规阅读框和弱展示的自身肽-MHC复合物。因此，自身反应性T细胞克隆型可能逃过阴性选择，并在胰岛中相关天然或修饰肽-MHC复合物变得更为丰富或稳定展示时作出应答。

2 β细胞作为应激敏感的新抗原发生器

胰腺β细胞并非自身免疫的被动靶标，其正常生理使其易受应激相关损伤。使其能够感知葡萄糖并快速产生、加工、储存和分泌胰岛素的同一生理过程，也给蛋白质折叠和质量控制系统带来持续压力。因此，β细胞可在广泛细胞死亡发生前改变免疫系统遇到的抗原物质。耐受性针对淋巴细胞发育期间可获得的自身抗原建立，并通过外周调节机制维持。仅在被应激β细胞中产生或富集的抗原结构，在免疫选择期间可能缺失、稀有或呈递方式不同。一旦在易感的炎症和MHC环境中被呈递，这些应激相关抗原可募集或激活自身反应性淋巴细胞，加剧组织损伤，并增加额外β细胞决定簇的释放和呈递。因此，β细胞应激可主动重塑自身免疫识别所作用的抗原底物。

2.1 分泌负担、前胰岛素折叠和组成性ER应激

胰岛素产生对β细胞ER施加异常高的生物合成需求。为响应血糖变化，β细胞必须快速调整前胰岛素合成，同时维持正确的二硫键形成、蛋白质折叠及通过ER和高尔基体的运输。适应性未折叠蛋白反应（UPR）通路在代谢应激期间上调伴侣蛋白表达、暂时减少翻译并增强ER相关降解以维持β细胞功能。因此，β细胞以与其正常分泌功能密切相关的组成性ER应激水平运行。UPR通过IRE1、PERK和ATF6协调，最初通过减少蛋白质流入、增加伴侣能力和促进错误折叠物质处理来保护β细胞。当分泌需求延长或质量控制机制不足时，适应性UPR可转向慢性功能障碍和细胞死亡。持续的ER应激可改变哪些蛋白质被保留、降解、切割或运输至分泌颗粒，从而改变可供免疫识别的肽段库。这一关系尤为重要，因为几种主要β细胞自身抗原集中在胰岛素分泌通路中。胰岛素和前胰岛素与IAPP、ChgA及其他颗粒蛋白一起加工和储存，其高局部浓度和共享蛋白水解环境为不完全加工、改变肽段边界和肽段融合创造了机会。

2.2 环境和炎症放大

与胰岛素产生相关的基础应激可被T1D相关的环境和炎症信号放大。浸润免疫细胞释放的细胞因子，包括IL-1β、IFN-γ、TNF和I型干扰素，可增加ER和线粒体应激、破坏β细胞身份、改变蛋白酶体和溶酶体加工并增强抗原呈递机制。病毒感染或病毒核酸传感可提供额外的应激层。模式识别和抗病毒干扰素信号可改变蛋白质合成，同时增加炎症和MHC表达。某些病毒暴露还可能扰乱ER膜、线粒体功能或细胞内钙处理。肠道病毒提供了最强的人类病毒学证据，尽管关联并不确立感染启动T1D。在部分新发疾病供体的含胰岛素胰岛中检测到肠道病毒VP1和低水平病毒RNA。病毒传感和I型干扰素信号可诱导HLA I类过度表达、ER应激程序、炎症趋化因子和β细胞凋亡。氧化还原失衡进一步将炎症暴露与抗原结构改变联系起来。葡萄糖刺激的胰岛素分泌依赖线粒体电子传递产生ATP，这一代谢过程也产生通常被解毒的活性氧（ROS）。在高代谢活性和胰岛炎症期间，增加的ROS和活性氮（RNS）可压倒β细胞相对有限的抗氧化能力。过量的ROS/RNS可损伤蛋白质和细胞器、破坏二硫键形成并产生改变蛋白质稳定性、切割或免疫识别的氧化或亚硝化修饰。ER功能还依赖严格调控的腔内钙。ER钙耗竭损害钙依赖性伴侣蛋白并破坏前胰岛素折叠，而增加的胞质钙可激活应激反应性修饰酶。细胞因子、病毒应答、氧化损伤和延长分泌需求均可扰乱钙稳态。

2.3 从细胞应激到抗原释放和免疫识别

细胞应激可通过几条不同途径多样化β细胞抗原库。化学修饰可改变氨基酸侧链，而蛋白水解变化可揭示隐蔽决定簇或产生具有新边界的肽段。然而，致密分泌颗粒内的独立反应可共价连接肽段片段形成HIP。应激还可能影响替代翻译、蛋白质周转和抗原加工的区室。尽管这些机制产生不同的分子产物，每种都可生成在胸腺选择和外周耐受期间缺失或代表性不足的肽-MHC复合物。应激和垂死的β细胞可通过颗粒周转、异常分泌、细胞外囊泡、凋亡小体和膜完整性丧失释放抗原物质。局部APC可获取该物质并在胰岛内或胰腺淋巴结中呈递。炎症信号同时增加APC激活，创造先前被忽略的决定簇可募集新自身反应性克隆或刺激交叉反应性受体的条件。由此产生的应答促进额外细胞因子产生和β细胞损伤，进一步增加细胞应激和抗原可用性。β细胞功能障碍、新抗原产生、抗原释放和免疫识别因此可形成支持T1D进展期间抗原多样化的自我放大回路。

3 应激诱导新表位模型在T1D中的发展

对理解T1D免疫病理学的核心贡献是发展了以组织为中心的模型，其中胰腺β细胞应激改变免疫系统遇到的抗原库。该工作提出并实验验证了分泌应激、炎症暴露、钙失调和氧化还原失衡可在终末细胞死亡前改变β细胞蛋白。2015年的概念综述确立了应激诱导抗原重塑的观点，强调β细胞异常高的分泌需求产生组成性ER应激，创造异常蛋白质折叠、加工和修饰可能发生的环境。2016年的机制研究直接测试了ER应激是否能增加内源性β细胞抗原的免疫原性，以及钙依赖性组织转谷氨酰胺酶2（TGM2）是否参与该效应。化学诱导ER应激增加原代小鼠胰岛的UPR信号，应激胰岛经APC加工呈递后比未应激胰岛引发更强的糖尿病性BDC2.5 CD4⁺ T细胞IFN-γ应答。ER应激还增加胞质钙和TGM2活性，降低胞质钙或TGM2表达可减少T细胞识别增加，支持从ER应激经钙依赖性酶活性到β细胞免疫原性的功能通路。2018年的转化研究结合HLA-DQ8结合分析、人类T细胞克隆、应激人胰岛和人胰岛素瘤模型，鉴定了IA-2和IAPP来源的修饰表位，其修饰形式被优先识别。IA-2谷氨酰胺残基的脱酰胺和IAPP残基的瓜氨酸化影响HLA-DQ8结合、TCR识别或两者兼有。从T1D个体分离的CD4⁺ T细胞克隆对修饰肽产生增殖和以Th1相关细胞因子为主的应答，而相应天然序列通常产生较弱或检测不到的应答。应激的原代人胰岛和βLox5胰岛素瘤细胞也刺激修饰表位特异性T细胞克隆。ER应激增加胞质钙以及TGM2和肽酰精氨酸脱亚胺酶2（PAD2）的活性。同年，合作工作提供了瓜氨酸化的补充证据。人胰岛暴露于IL-1β、TNF-α和IFN-γ诱导葡萄糖调节蛋白78（GRP78）内精氨酸510转化为瓜氨酸，经质谱确认。瓜氨酸化GRP78表位由HLA-DRB1 * 04:01呈递，并在T1D个体中引发较对照组增加的CD4⁺ T细胞和自身抗体应答。这些进展支持整合的正反馈模型：炎症细胞因子、病毒应答、代谢需求、化学暴露和氧化损伤可加剧β细胞分泌生理已相关的ER和氧化还原应激。ER钙释放可增加TGM2和PAD酶活性，而ROS/RNS可产生非酶促氧化修饰。当这些修饰或新加工肽段到达抗原呈递通路时，疾病相关MHC分子可展示在胸腺选择期间缺失或代表性不足的结构。

4 T1D领域的PTM和新表位机制

PTM和其他形式的非规范抗原生成通过生化上不同的机制扩展β细胞抗原库。检测到修饰蛋白确立了化学事件可在β细胞中发生，但并不能证明其肽段被MHC分子天然展示。增加的肽-MHC结合表明呈递优势，而离体T或B细胞反应性证明免疫识别而不一定证明致病性。体内β细胞损伤、明显疾病前出现和人类组织验证均提供不可互换的支持水平。

4.1 氧化和羰基PTM作为平行的应激依赖性通路

β细胞对氧化和亚硝化损伤特别敏感，因为葡萄糖代谢、二硫键形成和炎症信号产生ROS/RNS，而β细胞抗氧化能力有限。氧化和羰基化、半胱氨酸硫醇的S-亚硝基化和易感酪氨酸的硝化可破坏蛋白质折叠和功能、改变蛋白水解或肽-MHC结合，并创造新的免疫识别表面。羰基化蛋白二硫键异构酶A1（又称脯氨酰4-羟化酶β亚基，P4Hb）提供了跨越多个证据水平的例子。NOD小鼠高血糖前检测到胰岛蛋白羰基化增加，应激胰岛中羰基化P4Hb富集。该修饰与葡萄糖刺激胰岛素分泌受损和前胰岛素向胰岛素处理改变相关，而羰基-P4Hb在小鼠和人类T1D样本中引发自身抗体和CD4⁺ T细胞应答。氧化修饰胰岛素提供了互补的人类证据。T1D中检测到氧化胰岛素和氧化胰岛素衍生肽段的抗体，在纵向队列中为常规胰岛自身抗体谱增加信息，氧化胰岛素肽段也可引发T细胞应答。

4.2 PAD依赖性瓜氨酸化

瓜氨酸化由PAD酶催化，将肽酰精氨酸带正电的胍基转化为瓜氨酸的中性脲基。该反应不仅仅是蛋白质损伤的标志，还表明正电荷丧失可改变蛋白质构象、蛋白酶切割、肽段溶解度、MHC结合和呈现给TCR的表面。PAD酶是钙依赖性的，使ER和炎症应激期间的钙失调成为β细胞状态与瓜氨酸化抗原形成之间的合理联系。GRP78/BiP是特征最明确的瓜氨酸化β细胞靶标之一。炎症细胞因子增加人胰岛中GRP78瓜氨酸化，质谱鉴定Arg510处的瓜氨酸化。瓜氨酸化GRP78衍生肽段在HLA-DR4背景下呈递，并被T1D个体的T细胞和自身抗体识别。ER应激依赖性PAD活性与瓜氨酸化IAPP表位的产生相关，这些表位被T1D个体的CD4⁺ T细胞识别，炎症性葡萄糖激酶瓜氨酸化与酶功能改变和自身反应性应答相关。

4.3 TGM2依赖性脱酰胺和转酰胺

脱酰胺必须与脱氨基区分。在肽段脱酰胺中，含酰胺侧链（最常见为谷氨酰胺）转化为含羧酸盐残基，产生谷氨酸并引入负电荷。组织TGM2可在水作为酰基受体时催化谷氨酰胺脱酰胺，也可催化转酰胺，其中谷氨酰胺侧链与伯胺（包括赖氨酸的ε-氨基）交联。TGM2介导的脱酰胺与T1D相关HLA-DQ分子特别相关，因为谷氨酰胺转化为谷氨酸可改善偏好酸性残基的肽结合口袋的占据。胰岛自身抗原肽段的实验性脱酰胺增加了与HLA-DQ8或相关易感HLA-DQ分子的结合，并对选定肽段增强炎症性T细胞识别。人胰岛和树突状细胞可在炎症条件下产生脱酰胺胰岛抗原。ER应激引发的TGM2活性与T1D患者CD4⁺ T细胞对脱酰胺IA-2表位的识别相关。该效应具有抗原和序列依赖性，脱酰胺并未增加T1D个体中测试的C肽表位的免疫原性，而胰岛中形成的其他脱酰胺肽段可被人类CD4⁺ T细胞识别。

4.4 HIP作为翻译后融合新表位

HIP是由胰岛素或前胰岛素片段与第二肽段片段（通常源自IAPP或ChgA等β细胞分泌颗粒蛋白）共价融合产生的翻译后新表位。其定义特征是新肽键连接，创建在任一亲本蛋白中均不连续的序列。HIP形成因此在机制上区别于氧化、瓜氨酸化或脱酰胺等常规侧链PTM。融合肽段最初被鉴定为从NOD胰岛分离的致病性CD4⁺ T细胞克隆的配体，选定HIP通过质谱在β细胞材料中检测到。后续研究在人胰腺胰岛和外周血中鉴定HIP反应性T细胞，并证明人HLA-DQ8可呈递含胰岛素融合肽段。小鼠和人胰岛的质谱分析加强了至少部分预测HIP是天然形成而非仅作为合成T细胞激动剂的证据。酶学研究提示分泌颗粒致密肽段丰富环境中蛋白酶介导的转肽或逆蛋白水解，组织蛋白酶D可产生几种疾病相关HIP，而其他HIP异构体可能通过不同化学途径产生。

4.5 区分PTM与其他非规范抗原来源

几种机制在不构成常规PTM的情况下拓宽β细胞库。替代前体mRNA剪接可创建新外显子连接或改变异构体丰度；缺陷核糖体起始和翻译错误可产生规范开放阅读框缺失的肽段；改变蛋白水解可暴露隐蔽决定簇或改变肽段边界而不创建融合连接。这些通路可能在功能上汇聚，因为每种都可产生耐受期间缺失或代表性不足的肽-MHC复合物，但应在分类学上保持分离。

5 PTM、MHC-TCR识别和表位多样化

修饰和非规范β细胞肽段仅在加工、装载到易感MHC分子并被TCR识别后才具有免疫学意义。抗原多样化因此反映三个变量的相互作用：应激β细胞产生的肽段集合变化、疾病相关MHC分子的结合偏好和结构灵活性，以及可用TCR库的组成和交叉反应性。

5.1 I-A^g7和HLA-DQ8的结构易感性

NOD II类分子I-A^g7和人类T1D风险分子HLA-DQ8共享重要结构特征：两者均缺乏MHC II类β链57位通常存在的天冬氨酸。该相互作用的丧失改变P9区域的静电和几何性质，并偏好具有可补偿缺失负电荷的酸性残基的肽段库。在I-A^g7中，改变的P9口袋和相邻沟槽可容纳多种肽段阅读框和结合解决方案。PTM可利用这种结构易感性。脱酰胺将中性谷氨酰胺转化为带负电的谷氨酸，可为DQ8或I-A^g7创造有利锚定。HIP融合连接也可创造稳定结合DQ8或I-A^g7的新锚定组合。

5.2 胰岛素B链9–23残基的阅读框依赖性识别

胰岛素B链9–23残基（InsB:9–23）说明肽段阅读框如何将胸腺耐受与外周识别分离。由于InsB:9–23可以重叠阅读框结合I-A^g7，同一肽段的不同核心将不同残基暴露给TCR。NOD小鼠研究区分了一类识别常规APC加工的胰岛素蛋白的T细胞，与另一类对外源InsB:9–23肽段有效应答但对完整胰岛素应答差的T细胞。后者识别弱结合的替代阅读框，该阅读框在胸腺呈递期间低效产生或展示，但在胰腺胰岛内可用。该阅读框转换模型提供了胸腺逃逸的具体机制。T细胞并非必然对胰岛素蛋白无知，而是外周遇到的肽-MHC构象不同于介导阴性选择的主要构象。

5.3 结构简并性和β细胞肽段的交叉识别

TCR识别具有特异性但非绝对序列限制。单个TCR可在不同肽-MHC复合物保留足够相似的电荷、形状和可及接触残基三维排列时与之结合。这种结构简并性在β细胞分泌颗粒中尤为重要，其中高丰度肽段片段可被修饰或融合成一级序列不同但呈现相关表面的产物。HIP-MHC复合物的结构研究支持这一原理。胰岛素-IAPP HIP可产生优选的HLA-DQ8结合基序，并创建不同于任一亲本肽段的新TCR接触表面。