基于氧化应激与线粒体代谢相关基因的肝细胞癌预后模型构建及FZD7功能验证：一项整合多组学数据的生物标志物研究

《BioFactors》：FZD7 Shapes Mitochondrial Function and Oxidative Stress in Hepatocellular Carcinoma: A Potential Prognostic Biomarker

摘要专业翻译 线粒体代谢与氧化应激（oxidative stress, OS）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的进展中发挥关键作用。然而，针对这些过程仍缺乏可靠的预后生物标志物。本研究整合批量RNA测序（bulk RNA sequencing）与单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），以鉴定OS与线粒体代谢相关基因（OS&mitochondrial metabolism-related genes, OMRGs）。采用LASSO回归构建预后模型，并进行了外部验证。系统探讨了该模型与临床病理特征、肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）、免疫功能、治疗反应及药物敏感性的关联。最后，验证了关键OMRGs与线粒体代谢及OS之间的关系。研究建立了基于五个关键OMRGs（LPCAT1、IMPDH1、RAMP3、FZD7和B4GALT5）的风险评分。低OMRS与改善的总生存期显著相关，并被确定为独立的预后因素。基于OMRGs鉴定出两种亚型（C1/C2）：C1亚型表现出较差的生存率和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）富集，而C2亚型表现出更强的免疫浸润和对免疫治疗的敏感性。高OMRS与奥沙利铂和顺铂的较高预测半数抑制浓度（IC50）值相关，而低OMRS提示对肝动脉化疗栓塞（transarterial chemoembolization, TACE）、索拉非尼和免疫治疗的良好反应。FZD7敲低增加了HCC细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平并降低了线粒体膜电位。FZD7作为OMRGs中的关键基因，是HCC中具有前景的预后生物标志物和治疗靶点。

论文解读文章

一、研究背景与意义

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）作为原发性肝癌的主要亚型，占全球病例的80%以上，2020年报告死亡人数约83万，具有高发病率和高死亡率的特点。尽管手术切除和分子靶向治疗等策略不断进步，但由于晚期诊断率高和肿瘤固有的异质性，临床结局仍不理想。目前缺乏可靠的早期检测和预后分层生物标志物，亟需创新性的研究思路。

越来越多的证据表明，线粒体代谢与氧化应激（oxidative stress, OS）失衡在HCC发病机制中存在协同作用。线粒体作为细胞能量枢纽，不仅通过氧化磷酸化调控三磷酸腺苷（ATP）产生，还调节活性氧（reactive oxygen species, ROS）动态和凋亡信号。HCC组织中线粒体DNA突变密度高于正常肝组织，直接损害电子传递链效率并增加ROS生成。持续的氧化应激加剧线粒体膜电位去极化，形成代谢失调的自我延续循环。机制上，细胞色素c释放受损干扰caspase介导的凋亡，同时PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬下调约50%，导致病理性线粒体积累。临床上，线粒体超氧化物歧化酶（mitochondrial superoxide dismutase, MnSOD）活性降低与总生存期缩短相关，血清8-OHdG升高与术后复发风险增加相关。值得注意的是，线粒体复合物IV活性降低超过30%的患者对索拉非尼的应答率低58%，凸显了线粒体-ROS轴扰动对治疗的影响。

基于上述背景，本研究旨在通过多维生物信息学方法，鉴定与HCC患者生存相关的OS与线粒体代谢相关基因（OS&mitochondrial metabolism-related genes, OMRGs），构建并验证基于OMRGs的预后模型，以改善HCC患者的生存预测和治疗效果，为个性化治疗策略提供依据。

二、研究设计与技术方法

研究人员从TCGA数据库获取343例HCC样本的批量RNA测序数据和临床信息，利用Seurat分析单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据（GSE149614）。预后验证采用GSE14520（n=221）和ICGC（n=231）队列，另有GEO队列（GSE109211，n=67；GSE104580，n=147）用于评估关键OMRGs。四个免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）治疗队列整合为51例HCC样本的免疫治疗数据集，通过SVA包校正批次效应。

主要技术方法包括：基因集变异分析（gene set variation analysis, GSVA）计算OS&Mito评分；加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）鉴定与OS&Mito表型显著相关的模块基因；单细胞转录组分析结合AUCell算法鉴定高活性细胞亚群及其差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）；单因素Cox回归筛选预后相关基因；LASSO回归构建预后签名；共识聚类分析进行分子分型；基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析以及基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）解析生物学功能；CIBERSORT、EPIC、ESTIMATE、MCP counter、QUANTISEQ和TIMER等多种算法评估免疫浸润；肿瘤免疫功能障碍与排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE）算法预测免疫治疗反应；pRRophetic包预测药物半数抑制浓度（IC₅₀）；maftools包进行基因突变分析。体外实验中，研究人员在HuH-7细胞中通过小干扰RNA（siRNA）敲低FZD7，采用流式细胞术检测ROS水平和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）。

三、研究结果

3.1 WGCNA筛选TCGA-LIHC中与OMRGs相关的模块基因

研究人员利用37个与OS和线粒体代谢相关的交集基因，通过GSVA将其映射至TCGA-LIHC队列，随后进行WGCNA分析，确定最优软阈值为10。聚类树状图显示，粉色、紫色和蓝色模块与OS&Mito评分相关性最强。

3.2 综合scRNA-seq分析获取OMRGs

研究人员处理GSE149614 scRNA-seq数据集，鉴定出24个簇并注释为六种细胞类型，包括髓系细胞和HCC细胞。点图显示OMRGs在HCC细胞中高表达。AUCell分析以0.26为活性阈值鉴定活性细胞，t-SNE图显示HCC细胞主要分布在高评分组。高活性组与低活性组之间的DEGs经GO分析显示代谢通路富集，KEGG分析鉴定出碳代谢和药物代谢等通路，GSEA显示氧化磷酸化和凋亡等通路被抑制。

3.3 OS&Mito相关预后签名的构建与验证

研究人员通过Cox回归在TCGA-LIHC队列中鉴定出6344个预后基因，与单细胞分析筛选的13670个候选基因及WGCNA结果取交集，获得185个有前景的OMRGs。LASSO回归最终筛选出五个基因构建签名，风险评分公式为：RS=0.13256940×LPCAT1+0.04352273×IMPDH1?0.13240468×RAMP3+0.01815332×FZD7+0.01170158×B4GALT5。低OMRS组表现出更低的巨血管侵犯率、更低的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）水平和更早的肿瘤分期。在TCGA-LIHC、GSE14520和ICGC队列中，低OMRS组的总生存期显著延长，时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线显示良好的预后准确性。多因素Cox回归分析确认OMRS是独立预后因素，并据此构建了包含年龄、性别、AFP、肝功能、肿瘤分期和OMRS的列线图，校准曲线显示模型预测准确性高。

3.4 基于OMRGs的OS&Mito亚型鉴定

基于OMRGs表达进行共识聚类分析，将TCGA-LIHC队列患者分为C1和C2两个亚型。Kaplan-Meier生存分析显示C1亚型总生存期显著较差。功能富集分析显示C1亚型富集转移和代谢相关通路，而C2亚型中上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）信号显著抑制。

3.5 亚型间的生物学差异

免疫检查点基因表达水平在亚型间存在显著差异。KEGG通路分析显示氧化磷酸化与亚型鉴定结果一致正相关。免疫浸润分析显示C2亚型具有更高的CD8⁺T细胞和巨噬细胞浸润。TIDE算法显示C1亚型TIDE评分更高、微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）更低，提示C2亚型患者可能从免疫治疗中获益更多。突变分析显示C1亚型39%患者存在TP53突变，而C2亚型34%患者存在CTNNB1突变。

3.6 亚型间治疗反应差异

将免疫治疗、TACE和索拉非尼数据集按风险评分分组，累积分布图显示低风险患者对治疗反应更好，TACE组中应答者的风险评分低于无应答者。基于基因组药物敏感性癌症数据库（Genomics of Drug Sensitivity in Cancer, GDSC）预测138种药物的IC₅₀值，高风险与低风险组间存在显著差异。风险评分可预测放线菌素D、长春瑞滨、奥沙利铂、环磷酰胺、表柔比星和顺铂的IC₅₀值，其中LPCAT1和B4GALT5与奥沙利铂呈正相关，与长春瑞滨、表柔比星和顺铂呈负相关。

3.7 FZD7敲低对细胞内ROS水平的影响

在HuH-7细胞中，研究人员通过qPCR验证了FZD7敲低效率。野生型（WT）组ROS阳性细胞比例为18.02%，阴性对照（NC）组为16.58%，而si-FZD7组显著升高至30.03%，差异具有统计学意义（t=2.87，p<0.05）。结果表明FZD7敲低促进HuH-7细胞中ROS积累。

3.8 FZD7敲低对线粒体膜电位的影响

JC-1染色结果显示，WT组82.70%的细胞呈红色荧光，表明线粒体健康，NC组与WT组无显著差异。si-FZD7组红色荧光细胞降至73.69%，绿色荧光细胞增至24.78%，表明FZD7敲低显著损害线粒体功能。

四、讨论与结论

讨论总结

HCC细胞在肿瘤进展过程中常发生代谢重编程，特别是线粒体代谢通路的显著改变。当线粒体代谢失调时，表现为电子传递链功能障碍或膜电位降低，导致ROS生成增加。ROS不仅是代谢副产物，还在细胞信号传导和代谢调控中发挥关键作用。适度ROS可促进细胞增殖，而过度积累可能损伤线粒体DNA、蛋白质和脂质，最终加剧细胞应激或诱导凋亡。

本研究中，OMRGs在HCC细胞中高表达，OS&Mito高活性细胞亚群表现出代谢通路激活和应激相关通路抑制，提示其具有增强的生存能力和适应机制，可能代表更具侵袭性和韧性的肿瘤亚群。OMRS模型作为独立预后因素，具有良好的临床适用性。C1亚型与肿瘤促进过程激活相关，而C2亚型EMT信号受抑、代谢活性增强，提示更稳定的细胞表型和较低的转移潜力。C2亚型中CD8⁺T细胞、树突状细胞和M1型巨噬细胞浸润更高，ESTIMATE评分更高，表明免疫活性更强的肿瘤微环境，与更好的免疫治疗反应相关。C1亚型TIDE评分更高、MSI评分更低，反映增强的免疫抑制状态和降低的免疫治疗反应性。治疗反应分析显示低OMRS患者对免疫治疗、TACE和索拉非尼反应更好。高风险的IC₅₀值更高，提示对常用化疗药物敏感性较低。

体外功能实验证实，FZD7敲低显著增加细胞内ROS水平并降低线粒体膜电位，表明其在维持肿瘤细胞抗氧化能力和线粒体完整性中的关键作用。FZD7作为Wnt/β-catenin信号通路的关键受体，其过表达与肿瘤干性增强、转移潜能和化疗耐药相关。因此，FZD7可能作为HCC代谢靶向治疗或联合免疫治疗的新策略靶点。

研究结论

本研究利用OMRS构建了预后模型，揭示了亚型间免疫微环境和治疗反应的差异。该模型显示出强大的预测能力，支持个性化治疗决策，FZD7为理解HCC的调控机制提供了新见解。未来研究应验证这些发现并探索其在HCC精准医学中的临床应用。