同卵双生子着色性干皮病变异型（XP-V）相同POLH纯合突变下临床结局分歧：全基因组测序揭示体细胞突变负荷与顺铂相关差异

《HUMAN MUTATION》：Xeroderma Pigmentosum Monozygotic Twins: Same Mutation Divergent Clinical Outcomes

着色性干皮病（Xeroderma pigmentosum，XP）是一种罕见单基因病，以紫外线（UV）敏感性和皮肤癌易感性为特征，由核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）通路或编码DNA聚合酶η（DNA polymerase eta，Pol η）的基因突变引起，后者作用于跨损伤合成（translesion synthesis，TLS）。尽管XP是一种单基因病，但即使同卵双生子之间也可能出现临床严重程度差异。此处，研究人员报告同卵双生子（M3和M6）患XP变异型（XP variant，XP-V），尽管共享相似环境和习惯，但表现出临床严重程度差异。研究人员使用全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）评估其突变负荷和治疗策略的影响。研究结果证实了二者的亲缘关系，并确认两名患者均预期存在相同POLH突变。体细胞突变谱显示，患者M3携带显著更高数量的体细胞突变（p ≤ 0.0001），包括仅检测到ID8特征。尽管存在这些差异，双生子之间的突变谱仍高度一致（余弦相似度 > 0.98）。此外，由于其中一名患者接受了顺铂（cisplatin，CDDP）治疗，研究人员在体外证实了CDDP对TLS缺陷细胞细胞周期的影响。因此，对这些XP-V双生子患者基因组序列的分析揭示，在其一生中，内源性DNA损伤和治疗处理可能导致其基因组中高水平突变和表型分歧。

论文解读：同卵双生子XP-V相同POLH突变下临床结局分歧的基因组与功能研究

着色性干皮病（Xeroderma pigmentosum，XP）是一种罕见常染色体隐性遗传病，特征为DNA修复无效，发生率约为美国1/250,000至西欧1/450,000活产。XP由基因突变导致核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）通路或跨损伤合成（translesion synthesis，TLS）通路受损。NER负责移除体积较大的DNA损伤；TLS可旁路未修复且阻滞复制叉的DNA损伤，涉及DNA聚合酶η（DNA polymerase eta，Pol η）。POLH基因突变导致XP变异型（XP variant，XP-V）。不同通路基因突变及累积日晒可产生不同临床特征，包括UV敏感、日晒部位皮肤色素沉着，并增加肿瘤风险；20岁以下个体黑色素瘤风险约增加2000倍，基底细胞癌和鳞状细胞癌风险一般增加超过10,000倍。巴西XP诊断主要基于临床检查，特定基因检测较少；全外显子测序（whole exome sequencing，WES）为目前最特异基因检测，但需专业人员组装基因组及高容量数据处理基础设施，对多数患者经济上难以承受。缺乏WES分析可能限制治疗选择，因为识别特定异常基因对开发针对突变的治疗策略至关重要。预防方面，患者需使用高防晒系数（sun protection factor，SPF）防晒霜、佩戴太阳镜、穿长袖衣物和帽子，推荐深色织物以更好阻挡UV，并尽可能夜间活动以减少日晒。尽管XP为单基因病，同卵双生子间也可出现临床严重程度差异。本研究报道一对同卵双生子M3和M6，诊断为XP-V，尽管共享相似环境和习惯，但临床严重程度不同。二者携带POLH纯合突变，并接受不同化疗策略处理疾病并发症。WGS后识别出二者独有体细胞单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs）存在高度显著差异；临床更重且接受顺铂（cisplatin，CDDP）为基础化疗的患者M3，具有更多独有体细胞突变。因此，研究人员开展WGS、突变特征和细胞功能研究，以评估突变负荷及治疗策略影响，解释相同致病突变下的表型分歧。

关键技术方法概述：研究队列来源于巴西伯南布哥州Agreste地区Caruaru的Children′s Cancer Institute of Agreste临床诊断XP家系，包括同卵双生子M3、M6及自报近亲父母M4、M5，采集外周血。采用STR分型确认亲缘和同卵状态；WGS检测致病和体细胞变异；以Mutect2肿瘤-only模式结合panel-of-normals及callable区域过滤检出体细胞SNV/indel，ANNOVAR注释；以SomaticSignatures和MutationalPatterns分析96三核苷酸上下文及COSMIC v3.5 SBS/ID特征；pLogo分析序列基序。细胞实验使用XP-V与XP-V comp成纤维细胞系，CDDP处理，XTT测活力，碘化丙啶（propidium iodide，PI）流式测细胞周期。

研究结果：临床与家系特征方面，M3和M6为28岁男性同卵双生子，终身居住巴西伯南布哥Agreste地区Agrestina农村，同家庭，从事小规模养牛和挤奶，户外工作无充分防晒，无农药暴露，饮食相似，无吸烟史。M3临床更重，接受四周期CDDP、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）和多西他赛（docetaxel，DCT）化疗及六次放疗；右面部部分切除后上颌活动受限，影响进食并致体重下降。M6也接受化疗，但方案细节不可用。通过临床随访得出，M3肿瘤负担及手术后遗症更重，并发生右眼结节性黑色素瘤。基因分型与致病突变方面，通过STR和WGS确认亲缘概率>99.9%，同卵概率>99.99%；二者均携带POLH外显子6纯合胸腺嘧啶插入POLH c.672_673insT，导致移码并形成提前终止密码子p.Leu225Serfs^?33；该变异rs772778835对基因功能有害，曾在巴西东北部XP-V遗传聚集社区描述，gnomAD中杂合频率为0.01624。体细胞突变负荷方面，基于WGS和可调用区域分析，M3独有体细胞突变为18,574个，其中SNV 11,132个，indel 7,442个（插入3,403个，缺失4,039个）；M6独有体细胞突变15,392个，其中SNV 7,781个，indel约7,611个（插入4,070个，缺失3,541个）。总替代数差异极显著（p ≤ 0.0001），但按突变类型分析分布相似且无显著差异。突变谱与一致性方面，M3注释包括8,521个基因间、1,550个内含子、22个外显子、77个3′ UTR、8个5′ UTR、58个上游、54个下游、66个ncRNA外显子和776个ncRNA内含子变异；M6包括6,031个基因间、1,060个内含子、33个外显子、47个3′ UTR、6个5′ UTR、52个上游、42个下游、40个ncRNA外显子和470个ncRNA内含子变异。过渡/颠换比（transition/transversion，Ti/Tv）M3为1.02，M6为0.96。C > T替代占主导，M3和M6分别为3,208和2,171个；CpG位点中分别占34.16%和31%，YpY区域分别为52.43%和56.06%，其他上下文平均为13.4%和12.94%。96个SBS上下文余弦相似度达0.9862，表明突变过程高度一致。三核苷酸上下文与pLogo方面，C > T中ACA、ACG和GCG在二者均富集，CCG和TCG仅M3显著，CCT和TCT仅M6显著；M3 T > A中TTA突出，T > C中ATA、ATG和TTT显著。pLogo显示C > A基序M3为AAAC-AT、M6为AA-CAA，均富含腺嘌呤；C > T基序M3为WTACGTT、M6为ATACG，二者+1位G富集；T > C中M3为TATTT、M6为TTAT-TA；T > G中M3为TTTTTT、M6为TTT-T，均位于T富集区。COSMIC SBS特征方面，M3和M6主要由SBS3和SBS25贡献，但M6中二者分别比M3高约20%和13%；M3还显示SBS6和SBS37贡献，M6无额外特征。SBS3为同源重组修复缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）标志，SBS25与化疗暴露相关，SBS6与错配修复（mismatch repair，MMR）缺陷相关。Indel与COSMIC ID特征方面，indel总数差异不显著，但M3以缺失为主，M6以插入为主，差异高度显著（p ≤ 0.0001）。COSMIC ID特征中二者仅共享ID2，M6贡献30.2%，M3为14.6%；M3还显示ID8贡献44.3%和ID14贡献40.8%，M6显示ID1贡献25%和ID12贡献44.8%。ID1和ID2与聚合酶滑移相关，ID8与DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）经非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）修复相关。CDDP细胞活力与细胞周期方面，XP-V细胞较XP-V comp细胞对CDDP更敏感；2 h暴露时XP-V细胞活力较阴性对照明显下降，72 h暴露时下降更明显，1 μM浓度下存活仅略高于4%。XP-V comp细胞2 h暴露时各浓度活力仍高于80%，72 h后活力也降低但高于XP-V细胞。24 h后细胞周期进程未改变；72 h后XP-V comp细胞恢复G₁和G₂/M峰，而XP-V细胞停滞于G₁/S，未能通过S期。上述结果表明，即使共享相同POLH致病突变，内源性DNA损伤和治疗处理仍可能导致体细胞突变负荷和临床表型分歧；TLS缺陷增加CDDP敏感性，支持XP患者谨慎使用铂类化疗。

讨论部分总结：同卵双生子携带相同POLH致病变异且体细胞突变景观高度相似，但临床病程显著不同，提示XP-V疾病严重程度可能受致病变异之外的遗传和非遗传修饰因素影响。同卵双生子在很大程度上消除遗传背景差异，突出累积UV暴露、光防护行为、表观遗传调控和体细胞变异等额外修饰因素。既往北非XP研究和Cockayne syndrome（CS）研究显示，基因型-表型相关性并不总是直接。M3在6岁临床诊断XP时已有光化性角化病，而M6已发生基底细胞癌；M3在20岁发生右眼结节性黑色素瘤，M6虽也出现转移性疾病，但总体肿瘤负担和手术后遗症较轻。XP患者非黑色素瘤皮肤癌风险约增加10,000倍，黑色素瘤风险约增加2,000倍。M3接受CDDP、5-FU和DCT方案后临床恶化，肿瘤复发增加且愈合能力降低。Zhang et al.曾显示XP-C患者接受CDDP化疗后出现类似进展，CDDP严重不良反应可致死。5-FU代谢物FdUTP误掺入DNA，正常细胞由碱基切除修复（base excision repair，BER）和MMR处理，若修复失败则激活TLS；XP-V患者TLS受损，非癌细胞损伤更重。DCT通过特异性结合微管蛋白抑制有丝分裂，不直接作用于DNA损伤。限制在于M6肿瘤治疗信息不完整，无法确定CDDP对突变负荷差异和临床严重程度的特定贡献。POLH c.672_673insT曾在巴西Montanhas XP-V患者中首次描述，表型较温和；但M3更重，28岁时已接受超过30次肿瘤切除手术并出现右脸部分缺失和上颌活动受限。Castro et al.报告其XP-V患者仅一例在72岁发生黑色素瘤，而本研究中M3在20岁发生眼结节性黑色素瘤。这些发现强化XP-V缺乏直接基因型-表型相关性，临床严重程度受POLH突变之外因素影响。WGS使用外周血DNA，所识别体细胞变异为血液来源系统性改变，可能不能完全反映皮肤肿瘤突变景观。M3独有体细胞突变为11,132个，M6为7,781个；二者突变特征与化疗兼容，但完整化疗方案仅M3已知。该结果支持Hirsch et al.、Volkova et al.和Boot et al.关于CDDP治疗可增加突变负荷并产生特定特征模式的发现。C > T主导且Ti/Tv偏离人类基因组典型2.1–2.7，提示特定诱变过程。M3缺失4,039个、M6缺失3,541个，CDDP诱导链间交联，DSB经NHEJ修复时易产生小缺失。SBS3提示HRD，SBS25与化疗暴露相关，SBS6与MMR缺陷相关，SBS37机制未完全明确；ID2共享，ID1和ID2与聚合酶滑移相关，ID8与NHEJ修复DSB相关，ID12和ID14病因尚不明确。pLogo显示A富集和T富集基序及+1位G富集，提示二者共享相似诱变过程。细胞实验中XP-V细胞对CDDP约敏感3倍，互补功能性POLH后敏感性降低至正常水平；72 h后XP-V细胞停滞于G₁/S，XP-V comp细胞恢复。Sumiyoshi et al.和Gilbar and Pokharel报告XP患者顺铂严重甚至致死毒性，支持在有效替代治疗可用时避免铂类化疗，优先考虑免疫检查点抑制剂或其他非DNA损伤性治疗。

研究结论翻译：尽管共享相同纯合POLH致病性变异和高度相似的体细胞突变景观，同卵双生子表现出显著不同的临床病程，这突显XP-V疾病严重程度可能受致病变异之外的遗传和非遗传修饰因素影响。研究人员的功能实验证明对CDDP的细胞敏感性增加，提供机制性证据表明TLS受损增强对铂诱导DNA损伤的易感性，与既往XP患者严重顺铂相关毒性的临床报告一致。结合越来越多的临床证据，研究结果提供额外机制支持：只要有效替代治疗（包括免疫检查点抑制剂或其他非DNA损伤性治疗）可用，应避免铂类化疗。最后，本研究强调早期分子诊断对指导个体化临床管理、优化治疗决策和改善XP患者长期结局的重要性。