整合蛋白质基因组学揭示ESR1突变以情境依赖方式增强MTORC1信号并识别高复发风险乳腺癌

《Communications Biology》：ESR1 mutations are associated with enhanced MTORC1 signaling in a context-dependent manner

ESR1突变是乳腺癌内分泌治疗耐药（endocrine therapy resistance）的驱动因素，然而其对蛋白质信号通路（protein signaling pathways）和临床结局（clinical outcomes）的影响仍知之甚少。研究人员分析了携带ESR1突变肿瘤的转录组（transcriptomic）、蛋白质组（proteomic）和磷酸化蛋白质组（phosphoproteomic）图谱。在此，研究人员表明，ESR1突变癌症表现出更高的突变负荷（mutational burden），与细胞增殖（cell proliferation）增加相关，并通过MTORC1表现出mTOR通路（mTOR pathway）激活增强，提示ER驱动的已有致癌机制（oncogenic mechanisms）放大。对乳腺癌细胞系独立蛋白质组数据集的分析进一步支持MTORC1与ER信号程序（ER signaling programs）的汇聚（convergence）。整合多组学（multi-omic）数据分析，纳入肿瘤分级（tumor grade）、MTORC1信号和ESR1突变相关特征，使研究人员能够开发一种预测特征（predictive signature），以区分携带ESR1突变的患者并识别高复发风险（high risk of recurrence）患者。该研究为ESR1突变调控的肿瘤侵袭性（tumor aggressiveness）和不良临床结局机制提供了见解，并强调蛋白质基因组学（proteogenomic）方法在识别信号通路和分子特征方面的潜力。

论文围绕ESR1突变乳腺癌的蛋白质基因组学展开。雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ER；ESR1基因）阳性乳腺癌约占全部乳腺癌的四分之三，内分泌治疗（endocrine therapy）包括选择性ER调节剂、降解剂和芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitors，AI），可显著降低复发率。然而仍有30%–40%的ER阳性乳腺癌因原发或获得性耐药复发。ESR1突变在原发肿瘤中约占1%–3%，但在接受辅助内分泌治疗的转移性ER阳性乳腺癌中可高达50%，提示治疗驱动选择与扩增。这些错义突变主要位于受体配体结合域（ligand-binding domain，LBD），导致组成性激活，并介导对AI及其他内分泌药物的耐药。既往研究多来自临床前模型、转移瘤或转录组层面，缺乏对治疗初治原发临床肿瘤中ESR1突变如何从基因组转化为蛋白质组及下游信号的认识。因此，研究人员从SCAN-B研究中选择ESR1突变原发乳腺癌，整合蛋白质组和磷酸化蛋白质组，以解析其信号变化。

关键技术方法不超过250字：研究人员从SCAN-B前瞻性、真实世界、基于人群多中心早期乳腺癌研究中，选取27例ESR1突变原发肿瘤和108例wt ESR1对照，匹配ER、PgR、ERBB2、亚型及辅助内分泌治疗；质控后保留20例突变和86例对照。采用AllPrep RNA提取流穿液提取蛋白和磷酸肽，以数据非依赖采集质谱（data-independent acquisition mass spectrometry，DIA-MS）和谱图库定量9857个蛋白和8971个磷酸位点。分析使用多组学因子分析（multi-omics factor analysis，MOFA）、基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA）、激酶-底物富集分析（kinase-substrate enrichment analysis，KSEA）、Metascape、Cox回归、受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）和留一交叉验证（leave-one-out cross-validation，LOOCV）；外部验证采用METABRIC、TCGA、SweBCG91RT，并重分析细胞系蛋白质组PXD046446和RNAseq GSE147745。

研究结果如下。患者选择与蛋白质基因组数据集的产生：研究人员从超过3200例原发乳腺癌中筛选ESR1突变肿瘤，最终纳入20例突变和86例对照；DIA-MS获得深度蛋白质组和磷酸化蛋白质组。ESR1突变等位频率与无复发生存（relapse-free survival，RFS）和总生存（overall survival，OS）呈负相关但Cox回归不显著；在可用临床变量中，ESR1突变是唯一与不良预后显著相关的因素。所有突变位于LBD，包括Y537S和D538G，表达大多为杂合。

肿瘤分级、大小和增殖是蛋白质基因组变异的主要驱动因素：转录组与蛋白质组、蛋白质组与磷酸化蛋白质组总体正相关，但部分信号呈负相关。MOFA显示超过80.3%变异由转录本和蛋白定义，磷酸化蛋白质组占23.5%，单核苷酸变异（single-nucleotide variant，SNV）频率占3.4%；前5个因子解释大部分变异。因子1与高肿瘤分级、ERBB2扩增、高Ki-67和较大肿瘤显著相关。UMAP显示肿瘤分级而非ESR1突变状态形成聚类；高权重特征包括CDK1、MKI67及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分如VIM。GSVA结合线性模型显示，ESR1突变正向影响MTORC1信号、负向影响UV RESPONSE DN，但与分级相关通路无显著协同。结论是ESR1突变可能放大已有增殖和生存机制，并与主要肿瘤生物学决定因素并行。

ESR1突变肿瘤中升高的突变负荷依赖细胞增殖：研究人员从RNAseq中提取COSMIC基因SNV，排除ESR1后鉴定1651个错义变异，其中39个出现在两个以上样本。层次聚类显示PIK3CA、GATA3等腔面型常见改变，但突变与wt肿瘤无清晰分离。ESR1突变肿瘤的肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）显著更高，中位频率比为1.92；未发现与ESR1一致共突变的单个基因。TMB与G2M检查点、DNA修复、未折叠蛋白反应正相关，与血管生成和顶端连接负相关；ER转录和蛋白水平在突变与wt间无差异。结论为ESR1突变肿瘤TMB升高与细胞增殖相关，可能由加速细胞分裂导致。

ESR1突变癌症通过通路汇聚显示更高增殖：经典ER通路组分、FOXA1、GATA3和MKI67在转录或磷酸化层面变化不显著。GSEA在转录组和蛋白质组均显示细胞周期通路如E2F targets、G2M checkpoint和细胞生长通路MTORC1 signaling富集，炎症和干扰素信号下调。功能簇分析显示增殖和肿瘤微环境相关簇增加，Reactome富集于DNA与细胞复制及细胞黏附。Cox回归结合GSVA显示，MTORC1高活性与较短RFS和OS显著相关，而UV response与较好预后相关但不一致。结论是MTORC1信号可能是ESR1突变肿瘤增殖和侵袭的重要驱动。

MTORC1与雌激素信号汇聚增强ESR1突变癌症增殖：KSEA显示MTORC1下游RPS6KB1-2激活，上游抑制性激酶AKT1和PRKACA受抑制。相关性分析显示MTORC1与Estrogen Response评分正相关，但与ESR1转录水平仅弱相关，提示MTORC1激活并非直接由ESR1转录丰度驱动。重分析细胞系蛋白质组显示，MCF7Y537S较wt在完全培养基及24 h雌激素刺激下MTORC1通路富集，PRKCA降低，RPS6KB2和PRKD1增加；MTORC1蛋白集聚类3在Y537S中更丰富，富集代谢、氧化应激、TP53靶点和NFE2L2信号。Connectivity map提示mTOR、蛋白酶体和微管抑制剂可逆转突变表型；GSE147745的15个ESR1突变模型确认MTORC1与雌激素反应相关。结论为MTORC1激活依赖雌激素并在ESR1突变中进一步增强，呈情境依赖。

临床结局的整合预测模型：研究人员结合MTORC1信号、ESR1突变和肿瘤分级定义高低风险组，Kaplan–Meier分析显示风险组间有差异但不完全一致。进一步提取128个转录本、14个蛋白和2个磷酸位点构建多层模型；这些特征富集生长因子和ECM相互作用，且与MOFA因子1特征仅部分重叠。单层模型曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.694–0.781，LOOCV显示稳健；RNA模型在METABRIC、TCGA和SweBCG91RT中可分层。整合模型AUC为0.844，优于RNA模型0.685和磷酸化模型0.648，与蛋白模型0.752差异不显著；多变量Cox分析仍显著。蛋白中心16蛋白/磷酸位点模型AUC为0.818，多变量RFS和OS仍显著。结论是整合蛋白质基因组特征可预测患者风险，但需独立验证。

讨论部分总结：研究人员强调该研究使用治疗初治原发SCAN-B样本，减少既往治疗和转移异质性混杂。ESR1突变与较短复发时间和较差OS相关；绝经状态本身不影响生存，辅助放疗与较好预后相关。MOFA显示肿瘤分级和ERBB2扩增是分子变异主因，但二者未显著关联临床结局；AllPrep流穿液偏向可溶性蛋白，可能低估膜和ECM蛋白。COSMIC突变分析显示ER阳性乳腺癌常见改变，ESR1突变肿瘤TMB升高，但与单个驱动共突变或年龄无关，更可能反映增殖驱动的随机突变积累；未观察到APOBEC与ESR1突变明确关联。转录和蛋白层面显示细胞周期和代谢通路富集，炎症和免疫信号下调，与部分临床前模型中干扰素信号增加不同，提示不同ESR1突变和模型间的异质性及情境依赖。MTORC1信号是唯一在多层中与不良预后一致的富集通路；KSEA支持RPS6K激活和抑制性激酶活性降低。细胞系重分析支持雌激素依赖的MTORC1激活在ESR1突变中增强。治疗上，既往BOLERO-2、TAMRAD及EMERALD等试验支持内分泌治疗联合mTOR抑制，但耐药情境下联合建模仍具挑战。研究提出ESR1突变加剧已有代谢、生存和增殖机制的情境依赖模型；未建立ESR1突变与MTORC1之间直接调控层级，MTORC1可能是与肿瘤分级相关的平行增殖程序。预测签名目前仍属发现阶段，需在更大独立匹配多组学队列中验证。

研究结论翻译：本研究表明，蛋白质基因组学通过整合中心法则中从DNA和RNA到蛋白质及翻译后修饰的信息，在解析治疗耐药机制方面具有价值。该方法为推进对癌症生物学的理解和建立临床相关多组学生物标志物发现平台提供了稳健框架。